褪黑素的生物合成及對繁殖性能的影響

張 鈺，鄧學梅，廖晨星，劉國世*

1 中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193 2 中國農業大學三亞研究院，海南三亞 572025 3 北京首農食品集團有限公司，北京 100028

0 引言

褪黑素（Melatonin，MLT）又稱N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一種廣泛分布在微生物及動植物體內的吲哚類激素。褪黑素是由Lerner等人于1958年從松果體組織中分離發現，在人們最初的認知中，動物體內僅有松果體能夠分泌褪黑素，且功能上僅限于調節個體的晝夜節律以及季節信號。但是在隨后的幾十年間發表的研究結果表明，大部分的器官組織都能夠合成褪黑素，例如視網膜、胃腸道、性腺等[1]。而且褪黑素還具有調節機體免疫和廣譜抗氧化功能，能夠減少生殖系統及其他組織器官受到的氧化應激、炎癥損傷以及細胞凋亡的發生[2]，并根據機體不同的發育階段和外界環境的季節變化表現出相應的促進或抑制發情的功能，調節生殖系統活動，改善動物的繁殖能力。本文綜述了褪黑素在生物機體內合成途徑及分泌調控機制、抗氧化和免疫調節機制以及對動物生殖系統、胚胎發育和繁殖能力的影響，以期為后續動物輔助生殖技術的發展提供新的思路與見解。

1 褪黑素的生物合成及功能

雖然多種組織器官都能夠分泌褪黑素，但只有松果體和眼部的視網膜組織能夠呈現周期性的分泌活動，其生物合成受到外界光照條件呈現出晝夜節律性以及季節特征。功能上，褪黑素能夠鏈接外界光照信號變化和機體內多種生理活動節律[3]，對神經系統具有良好的保護作用，能夠調節晝夜節律變化并對精神疾病具有良好的治療效果[4]。此外褪黑素還具有廣譜抗菌作用[5]以及免疫調節功能[6]。

1.1 褪黑素的生物合成

褪黑素最初是從動物體內的松果體分離并鑒定[7]，但隨著研究的深入，有研究者發現腸道和卵泡等多種組織器官也能夠合成褪黑素[1]，并作為自分泌和旁分泌信號調節生理活動。脊椎動物的胃腸道色氨酸作為褪黑素生物合成的前體被小腸吸收進入血液循環，松果體細胞主動攝取，經過色氨酸羥化酶作用形成5-羥基色氨酸，再經過芳基烷基胺-N-乙酰轉移酶（AANAT）轉化為N-乙酰血清素，最后在乙酰血清素O-甲基轉移酶（ASMT）的作用下成褪黑素[8]。在這個過程中，AANAT是主要的限速酶，其生物活性能夠調控褪黑素的合成速度。AANAT基因中的調節/結合序列能夠編碼cAMP操作的結合開關，cAMP調節的蛋白激酶催化的磷酸化促進與14-3-3蛋白質復合物的形成。這種AANAT/14-3-3復合物的形成通過屏蔽AANAT的去磷酸化或蛋白水解，并降低血清素的K（m）來增強褪黑激素的產生[9]。Yalikun S等[10]的研究進一步確定褪黑素是在線粒體基質中合成的。松果體合成褪黑素后迅速釋放至血液及脊髓液中[11]，與血漿蛋白結合并分布到大多數身體組織中[12]發揮作用。

另一方面，有許多研究指出，部分細菌和真菌[13]也具有合成褪黑素的能力。Tilden等[14]通過控制光照條件，發現一株需氧光合細菌-長紅桿菌在光照較弱的條件下能夠合成并分泌褪黑素，但是自然狀態下的微生物合成褪黑素的效率及濃度較低，不能滿足將其分離提純及應用的需求。隨著微生物基因組、基因工程技術和發酵工程的發展，越來越多的研究利用經過基因工程技術培養的工程菌合成一些具有較高價值或者難以人工合成的物質[15]。利用工程菌發酵轉化物質，具有方便快捷、安全高效，降低成本等特點。其中大腸桿菌是研究人員常用的宿主菌，部分大腸桿菌的質粒能夠編碼T7溶菌酶，能夠大量表達目的蛋白，而且能夠抑制宿主自身蛋白的正常表達[16]。有研究人員利用基因工程技術，將油菜黃單胞桿菌攜帶的苯丙氨酸4-羥化酶（P4H）、水稻攜帶的咖啡酸3-O-甲基轉移酶（COMT）基因以及白鏈霉菌的藻毒素合成基因構建載體后導入到大腸桿菌中，并利用蛋白質工程和代謝工程技術，成功地讓大腸桿菌大量表達褪黑素[17]。

1.2 褪黑素的生物學功能

1.2.1 褪黑素調節生物節律

褪黑素具有調節動物晝夜節律的功能[18]，在夜晚，光照條件較弱的條件下，內源性褪黑素大量合成，促進并改善睡眠質量。而在白天，受光照刺激，松果體分泌褪黑素會受到抑制[4]。有研究指出，外界光照條件變化能夠通過局部視覺器官（IOP）影響松果體合成并分泌褪黑素的水平，進而調機體的睡眠狀態[19]。這提示，機體通過視覺器官感受外界光照變化，并將信號傳遞至松果體，由松果體將視覺器官傳遞來的光照變化信號轉變為褪黑素信號，從而調節機體的晝夜節律。Zhang等[20]通過基因編輯技術構建褪黑素上調的下調的小鼠模型，發現褪黑素上調的小鼠睡眠時間要明顯高于褪黑素下調的小鼠，試驗結果充分說明了褪黑素對機體晝夜節律的調節作用。

1.2.2 褪黑素調節機體免疫

褪黑素具有免疫調節功能，在不同的炎癥情況下能夠表現出促炎作用和抑炎作用，能夠提高機體對外源或內源抗原的抵抗力以及恢復力[21]。在血液中，褪黑素能夠刺激單核細胞產生活性氧（ROS），而適度產生的ROS能夠激活其他免疫細胞[22]，促進機體免疫系統發揮防衛功能。有研究指出，褪黑素能夠作用于人單核細胞U937的細胞膜表面的褪黑素受體1和褪黑素受體2（MT1、MT2），刺激胞內產生活性氧，并且產生的活性氧濃度不會造成細胞的氧化應激損傷[23，24]。激活后的單核細胞能夠分化為巨噬細胞并合成趨化因子以及相關炎癥因子從而發揮免疫調節功能。在其他研究中，褪黑素能夠作用于免疫細胞的細胞膜表面的MT1，從而上調白細胞介素2（IL-2）受體的表達，并緩解前列腺素對IL-2的抑制作用[25]。另一方面，褪黑素在機體處于嚴重炎癥的情況下能夠表現出抑制炎癥的作用。由研究人員利用右旋糖酐硫酸鈉（DSS-）誘導小鼠神經炎癥和肝損傷，通過給予外源性褪黑素后，能夠增加短鏈脂肪酸的合成，緩解小鼠的神經炎癥[26]。同時，褪黑素還能抑制小鼠腸道中法尼素X受體成纖維細胞生長因子15（FXR-FGF 15）和肝臟中凋亡信號調節激酶1（ASK1）的過度激活，緩解腸道炎癥以及肝臟代謝紊亂。

1.2.3 褪黑素的抗氧化作用

褪黑素具有廣譜抗氧化活性[6]，能夠通過清除多余自由基、刺激內源性抗氧化酶和提高其他抗氧化劑的效率等多種機制[27]限制氧化損傷。進一步說，褪黑素能夠通過氫原子轉移（Hydrogen Atom Transfer，HAT）、質子耦合電子轉移（Proton Coupled Electron Transfer，PCET）、自由基加和物（Radical Adduct Formation，RAF）、單電子轉移（Single Electron Transfer，SET）、序貫電子質子轉移（Sequential Electron Proton Transfer，SEPT）等機制直接清除機體內過氧基（Peroxyl Radical，ROO）、羥基自由基（Hydroxyl Radical，OH）、氨氧基（Nitric Oxide，NO）等自由基[28]。Mekhloufi等[29]在體外構建脂質模型，并檢測褪黑素與氫過氧化物的清除作用，試驗結果表明，褪黑素能夠直接與羥基自由基發生反應并進行清除。褪黑素還能夠螯合Cu2+、Fe2+、Zn2+、Al3+和Mn2+等有毒金屬離子[30]，降低金屬離子催化的分子損傷并抑制其與β-淀粉樣肽相互作用產生自由基[31]，間接發揮對機體的抗氧化及保護作用。有研究指出，褪黑素對Cu2+介導的脂質過氧化[32]以及Cu2+/H2O2誘導的金屬催化氧化（Metal-Catalyzed Oxidation，MCO）和蛋白質損傷[33]具有保護作用。此外，褪黑素還能通過電子轉移的過程增加谷脫甘肽、抗壞血酸和水溶性維生素E的抗氧化作用[34]。

2 褪黑素對動物繁殖的影響

褪黑素能夠作用于“下丘腦-垂體-性腺軸”調控動物的繁殖活動[35]，對動物的生殖具有多方面的影響。在未成熟動物體內，褪黑素能通過抑制內源性GnRH的分泌[36]來抑制其性成熟、自發性排卵和發情反應[37]，在成熟動物體內，褪黑素又能起到一定的促進作用[38]。這種現象在一定程度上說明褪黑素對于未成熟動物具有一定的保護作用，防止其由于過早參與繁殖活動，造成生殖系統及其他組織器官的損傷。另一方面，在哺乳動物中，下丘腦視交叉上核能夠通過視網膜下丘腦束接收光刺激，從而調節松果體合成并分泌褪黑素的節律性。褪黑素主要在在夜間分泌，分泌量與白天日照時間長短成反比。通過這種方式將光周期信號轉變為動物體內褪黑素含量的變化，從而調節季節性發情的動物的繁殖周期[39，40]。

2.1 褪黑素對雄性生殖系統的影響

褪黑素能夠顯著改善雄性生殖系統的狀態，并且MT1和MT2能夠介導除褪黑素之外的其他激素信號，并上調睪丸激素水平[41]。在胚胎和幼年階段，褪黑素能夠通過與睪丸組織中的MT1和MT2結合，促進雄性激素的分泌以及生殖系統的發育和成熟[42]。在成年后，褪黑素能夠促進雄性激素的分泌以及精子的形成，并促進季節性發情動物進行繁殖活動[43]。此外，褪黑素固有的抗炎作用以及抗氧化作用對雄性生殖系統也有幫助。有研究報道，褪黑素能夠提高冷凍保存的精原干細胞（SSCs）的存活率，減少由于凍融過程中細胞內產生的ROS[44]。另一方面，褪黑素對雄性動物生殖疾病有良好的預防及治療作用。由革蘭氏陰性細菌引發的睪丸炎會抑制雄性激素的合成以及精子的發生，其細胞壁中的脂多糖（LPS）能夠與toll樣受體4結合并引起機體免疫系統做出反應。而褪黑素能夠增強睪丸中巨噬細胞的吞噬能力，并抑制p38 MAPK通路和促進Leydig細胞睪酮分泌來抑制TM促炎因子的分泌，從而抑制炎癥反應[45]。

2.2 褪黑素對雌性生殖系統的影響

微觀上，褪黑素通過下丘腦-垂體-性腺軸調控畜禽的生殖激素的分泌，主要是GnRH和LH。有研究表明，外源褪黑素能夠上調腦部GnRH-1、GnRH-3和幾種GnRH受體的轉錄水平，且相同劑量下這種影響的程度受到外界光照條件的影響。這表明外源性褪黑素加強了已經建立的GnRH系統的生理機制。另有研究表明，在雌性小鼠切除卵巢后能增加松果體分泌的褪黑激素的含量。但是在雄性小鼠體內沒有觀察到這種現象。這表明GnRH可能參與調節成年雌性大鼠松果體褪黑激素的分泌[46]。

雌性動物在排卵的過程中，線粒體能夠合成大量的褪黑素，不僅能夠清除因各種途徑產生的活性氧（ROS），還能夠促進卵母細胞的成熟，在一定程度上提高畜禽的繁殖性能。Tian等[47]采用放射免疫法測定牛卵泡液中褪黑素的濃度約為10-11M，隨后的試驗指出補充外源褪黑素能夠上調GDF9、MARF1、DNMT1a等卵母細胞成熟基因和PTX3、HAS1/2等卵囊擴張相關基因，促進卵母細胞成熟。Tao[48]等通過構建豬顆粒細胞（GCs）缺氧模型，并用褪黑素進行處理，發現褪黑素能夠降低ROS水平并提高超氧化物歧化酶1（SOD1）等抗氧化酶的表達、抑制GCs中caspase-3的激活、提高GCs的活力并減少凋亡。

畜禽在妊娠過程中容易產生妊娠并發癥導致子宮內炎癥及自噬，褪黑素能夠抑制炎癥狀態下的IL-10、TNF和IL-6水平的升高[49]，改善妊娠過程。Lee等[50]對妊娠小鼠給予外源褪黑素，也得到了相似的結果。在畜禽的輔助繁殖技術方面，褪黑素能夠上調減數分裂后期標記基因Dnmt3a和Bcl-2的表達并下調Bax表達，從而促進精原干細胞向功能精子的分化[51]。劉佳慧等[52]在體外條件下用1 nmol/L褪黑素處理未成熟的豬卵母細胞，發現可顯著改善卵母細胞成熟質量，抑制多精受精的發生。

2.3 褪黑素對早期胚胎發育的影響

褪黑素不僅能夠影響雌雄配子的形成，還能進一步影響早期胚胎的發育。褪黑素能夠增加囊胚期細胞內mt RNA 拷貝數、線粒體膜電位和線粒體的分布，抑制p53、Bax等凋亡基因表達并促進SOD1、GPx4等抗氧化基因的表達，從而改善囊胚期胚胎線粒體功能，促進早期胚胎發育并提高囊胚質量[53]。MT1在胚胎發育早期就已經開始表達[54]，MT1在未卵裂的激活卵母細胞中主要分布于細胞膜上，隨著孤雌胚胎卵裂的進行，受體表達量逐漸增加，主要表達定位于細胞膜上，隨著胚胎發育的進行，MT1在卵裂球內部開始表達和分布，退化胚胎中MT1表達水平較低。王凱娟等[55]研究發現用10-9mol/L的褪黑素處理IVF受精后的卵泡，能顯著提高囊胚形成率以及優質囊胚率，提高胚胎質量。佟桂芝等[56]在牛體外胚胎生產全程添加不同濃度梯度的褪黑素，發現10-9mol/L的褪黑素能夠顯著提高牛卵母細胞卵裂率、囊胚率及囊胚細胞數。此外，在胚胎附植過程中，褪黑素能夠結合MT2受體，促進子宮內膜接受態的建立。研究發現，在妊娠早期小鼠子宮內褪黑素合成限速酶AANAT的表達量增加，且妊娠第二天的子宮腔上皮細胞和子宮腺中MT2受體特異表達[57]。注射補充15 mg/kg劑量褪黑素后，小鼠子宮內膜厚度以及子宮腺密度上升，且著床部位的數量和窩仔數顯著上升。

2.4 褪黑素對乳腺泌乳的影響

動物幼崽在剛出生的一段時間內，機體無法合成內源性褪黑素[58]，需要通過攝入母乳中的褪黑素來調節自身生物節律并促進免疫系統發育。因此，哺乳期母乳中的褪黑素含量對于幼崽的早期發育至關重要。馬騰等[59]構建綿羊羊褪黑素合成限速酶基因AANAT和HIOMT的線性化表達載體，結合輸卵管移植術，成功構建過表達褪黑素合成酶的轉基因羊模型，且母乳中褪黑素含量顯著升高。楊愛玲等[60]對該轉基因羊模型的生長性能、多項生理指標以及乳成分進行分析，結果顯示與空白對照組綿羊無明顯差別，僅褪黑素和乳糖含量升高、體細胞數含量降低，推測原因可能是乳腺中的褪黑素含量上升，發揮其免疫調節功能降低了乳中體細胞數。

3 總結與展望

褪黑素是連接外界光照條件變化與體內生理活動變化的關鍵信號分子，動物眼睛的視網膜接收光照信號變化后將信號傳遞給松果體，隨后松果體將光照信號轉化為褪黑素，從而參與機體內各項生理反應。褪黑素能夠從多角度調節機體抗氧化和免疫反應，并以此改善動物的繁殖性能。隨著動物輔助生殖技術的發展，人們對于動物繁殖過程中的各種生理變化更加熟悉，也發現越來越多限制動物繁殖性能的問題，前人的研究已經充分顯示褪黑素對于提高動物繁殖性能的作用，或許可以作為未來解決動物輔助生殖的關鍵因素。但是對于不同物種或品種動物，褪黑素及其異構體的給藥方式仍需進一步研究。