牛奶中褪黑素含量的檢測方法

沈紫霞，常 毅，劉巧香，郭 剛，馬 慧，李有志，廖晨星*，劉國世*

1 中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193 2 北京首農食品集團有限公司，北京 100028 3 山東省飼料獸藥質量檢驗中心，山東濟南 250109

0 引言

褪黑素（Melatonin，MT），化學名為N-乙酰基-5-甲氧基色胺，屬于吲哚類色胺，一種主要由松果腺分泌的神經內分泌激素[1]。褪黑素不僅在催眠、抗衰老、調節免疫、抗腫瘤方面有一定成效[1]，還可以維持機體內的代謝穩定[2]；在實際生產中，褪黑素對降低牛奶中體細胞數、改善乳品質方面有著顯著的效果[3]。然而在許多國家和地區，人工合成的褪黑素是不能作為添加劑存在的，因此許多研究者都開始關注天然生物褪黑素產品這一研究熱點[4]。作為大眾消費最多的乳制品，牛奶含有天然褪黑素，是外源性褪黑素的良好補充來源。在動物機體內，褪黑素進入血液循環后會經脈絡膜濃縮，再分泌進入腦脊液與血漿蛋白結合，并以這種形式被運輸至各個組織或器官，發揮相關作用[5]，因此褪黑素的作用是多方面的。有研究表明，褪黑素可以調節晝夜節律和抗氧化，對生殖系統、免疫系統和消化系統存在積極影響[6]。天然高褪黑素奶對人和動物都具有重要的生物學意義，如果可以通過合適的檢測方法鑒定出褪黑素含量高的牛奶，并以此哺乳犢牛，可能會更有利于犢牛的生長發育[3]。但具體結論仍需進一步探索。隨著有關生產天然高褪黑素奶的研究增多[7]，人們在尋找更高效便捷的褪黑素檢測方法上存在一定的迫切性。傳統的褪黑素含量檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）、放射免疫測定法（RIA）以及酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、紫外分光光度計法（UV）等[8]。本文就以上幾種傳統的褪黑素含量檢測方法展開綜述，介紹并對比其原理、優缺點以及應用范圍，為今后天然高褪黑素奶的篩選提供一定技術支持。

1 褪黑素檢測方法

1.1 氣相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法

氣相色譜法（GC）是一種以氣體為流動相的柱色譜法，根據所用固定相狀態的不同可分為氣-固色譜（GSC）和氣-液色譜（GLC）[9]。質譜分析法主要是根據被測樣品離子的質荷比來進行分析[9]。采用氣相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法測定褪黑素時，毛細管柱和程序升溫較為常用，如以15℃/min的升溫速率從60 ℃升至280 ℃并持續5 min，或是在90 ℃持續1 min后再升溫至275 ℃并持續10 min。載體通常選擇電離電位較高的氣體（如氦氣），質譜均采用電子轟擊70 eV離子源。在上述條件下，樣品中的褪黑素、其他藥物和雜質能夠完全分離并得到各自的MS圖[10]。采用外標法或是同位素內標法進行峰面積定量[11]。

該方法有以下幾點優勢：（1）分析速度快、分離效率高：由于樣品在氣相中傳遞時的快速性，樣品組分在流動相和固定相之間可以瞬間達到平衡狀態；（2）適用范圍廣：氣相色譜法中可選作固定相的物質有很多；（3）靈敏度高：氣相色譜法可與高靈敏選擇性檢測器結合使用[9]，氣相色譜-質譜聯用法在生物樣品中的檢測限可達1 pg/mL。但這類方法也存在一些缺點，比如無法直接測定難揮發物及選擇性差[12]，在檢測過程中需要衍生，耗時較長等[13]。

1.2 高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯用法

在諸多褪黑素測定方法中，高效液相色譜法（HPLC）是使用最廣泛的[14]。它的原理是以液體作為流動相，用高壓輸液系統把不同極性的緩沖液、溶劑等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離，隨后進入檢測器進行檢測，從而實現對樣品的分析[15]。高效液相色譜測定通常采用反向C18填料，大多采用70∶30到50∶50的甲醛-水作為流動相[16]，另外也有使用磷酸鹽緩沖液-乙腈[17]的。由于褪黑素的極性較小，流動相的pH對色譜影響不大，一般采用流動相pH范圍為3～4，多采用磷酸鹽、冰乙酸等控制[18]。檢測生物樣品（如牛奶）時，由于紫外檢測器的靈敏度較低，一般不采用，常采用靈敏度較高的電化學檢測器（ED）或熒光檢測器（FD）。高效液相色譜測定褪黑素時通常采用外標法定量，標準曲線在較大濃度范圍具有良好的線性[19]。

高效液相色譜具有高效、高速以及高分辨力等優點，與合適的檢測器聯用后牛奶中褪黑素檢測限可達1 μg/mL[20]，但該法的前處理步驟繁瑣、耗時長[13]。高效液相色譜通常與質譜分析法聯用，即高效液相色譜-質譜聯用法，其分離度和靈敏度比高效液相色譜更高[13]，對空氣中目標物的檢出限可達0.2 ng/mL[21]，牛奶中褪黑素的檢測限數量級在10 pg/mL，且該法也具有更廣的使用范圍。

1.3 放射免疫測定法

放射免疫分析（RIA）的本質是標記抗原和非標記抗原對特異抗體的競爭性抑制反應[22]。褪黑素的放射免疫分析測定是利用標記褪黑素與特異的免抗血清結合，在反應平衡后加入待測樣品，溫度恒定在4 ℃，待反應充分平衡再進行分離并測量計數[22]。放射免疫分析測定法的操作步驟包括抗原的制備與標記、特異性抗體的制備以及抗原抗體復合物與游離抗原的分離。當需要同時測定大量樣品時，一般選擇放射免疫測定法[8]。該法中的125I-褪黑素這類抗原在應用前需要進行氧化制備及高效液相色譜分離；而抗原3H-褪黑素則需要脂、水兩溶的閃爍液激發測定[22]。

放射免疫測定法優點在于褪黑素不必提純就可以測量，同時能達到較高的靈敏度，檢測限可達1 pg/mL[23]，重現性也不錯[22]。但不足之處在于其測量值僅代表免疫學活性，檢測過程中會使用放射性同位素，而且它的測定不易被標準化[24]。

1.4 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定（ELISA）是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型免疫測定技術[22]，它的原理在于將抗原抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合[25]。這種方法既可以用來測定抗原也可以用來測定抗體。在反應過程中，對固相載體上的酶標抗原或抗體被結合量等進行統計、分析，通過洗滌處理去除反應液中的其他物質，在加入酶反應底物后，底物可以通過酶催化轉變為有色產物，最后采用定性或定量分析的方式，對有色產物量進行檢驗分析，以達檢測目的[26]。鑒于其高靈敏性，近年來逐漸有研究者采用酶聯免疫吸附試劑盒測定牛奶中褪黑素的含量[27]。根據具體操作過程不同，酶聯免疫吸附測定分為多種類型，如雙抗體夾心測抗原、雙抗原夾心測抗體以及競爭法測抗體或抗原等都是常見的幾類酶聯免疫吸附測定法。

酶聯免疫測定技術的敏感性高，檢出限為每孔0.2 pg[8]，反應物穩定性較高，相對放射免疫測定法來說不存在放射性危險。但這種方法對實驗設備和操作的高要求性限制了其應用范圍[22]。

1.5 紫外分光光度法

紫外分光光度法（UV）是根據組分含量與吸收光譜呈線性關系進行分析，它一般與多種化學信息學方法相結合，從而對多組分混合物進行定性定量分析[28]。由于褪黑素易溶于甲醇、不溶于水，因此在使用紫外分光光度計法測定褪黑素時，可以直接以甲醇作為溶劑來進行超聲提取，也可以直接采用無水乙醇為溶劑提取（保證振蕩充分）。當待測樣的輔料為微晶纖維素、淀粉、碳酸氫鈣等物質時，可以使用紫外分光光度計法，不會干擾測定。但當輔料成分比較復雜或含有其他吲哚類藥物時，對待測樣品處理的要求會比較高，這種情況往往不建議使用該法。因此在褪黑素的含量測定中，紫外分光光度計法一般只用于制劑輔料較為簡單的情況，再結合導數分光光度法，能得到較好的標準曲線線性關系，結果準確、可靠。褪黑素在紫外光波長為223 nm和277 nm處有最大吸收，目前常選用277 nm作為檢測波長[8]。同時采用外標法定量，能夠具有良好的線性。

由此可見，紫外分光光度計法的優點在于可以對多組分混合物進行分析測定，結果也較為準確可靠，最低檢測限為0.025 μg／mL[8]。但該法對待測樣品要求較高，樣品成分較復雜的情況下不推薦。

2 小結

在上述提到的幾種測褪黑素的方法中，氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜-質譜聯用法的靈敏度高于氣相色譜法和高效液相色譜法。與氣相色譜-質譜聯用法相比，高效液相色譜-質譜聯用法在特異性、適用性以及樣品檢測量方面都存在較大的優勢。但這幾種方法也存在耗時較長、成本相對高的弊端。與之相反的是放射免疫測定法，對于待測樣品中的褪黑素不必提純就能進行測量，比較適合樣本量較大的情況，目前放射免疫試劑盒的應用也相對比較普及了。但放射免疫測定法的測定不易標準化，測值可靠度不全面。酶聯免疫吸附法不存在放射性危險，且該技術敏感度較高，但由于實驗設備及操作的原因無法廣泛使用。紫外分光光度計法只適合成分較簡單的待測樣品，如褪黑素片劑或膠囊，這類樣品輔料成分簡單，不存在干擾結果的情況；像牛奶這類成分較復雜的生物樣品一般選用高效液相色譜-質譜聯用法較為合適。