易損斑塊相關生物標志物的研究進展

葛強，徐政昊，袁蔚，申瀟竹，劉希光

1.徐州醫科大學附屬連云港醫院，江蘇連云港 222002；2.連云港市第二人民醫院老年醫學科，江蘇連云港 222000

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種可累及全身各處動脈的自身免疫性疾病，主要為大中動脈，病因錯綜復雜。病程進展緩慢，呈進行性加重，一般從脂質沉積、局灶性纖維化、粥樣斑塊逐漸發展為管壁彈性下降、管腔狹窄，最終導致動脈閉塞，引起心肌梗死或缺血性卒中等急性事件。在動脈粥樣硬化患者中，頸動脈斑塊往往是最早識別的靶點，可通過觀察頸動脈的狀態來評估其他動脈血管情況。不僅如此，頸動脈斑塊的形成可獨立預測腦血管緊急事件的發生，約20%的缺血性卒中源于它。有研究發現，頸部非狹窄性易損斑塊對卒中的發生及后續復發風險均有重要的影響[1-2]。因此盡早發現易損斑塊，積極治療，可預防急性腦血管意外。但是易損斑塊的形成機制仍不是很明確，故本文對頸動脈易損斑塊形成的發病機制進行了總結，以尋找可以作為治療靶點的循環生物標志物，為指導臨床治療提供依據。

1 易損斑塊

動脈粥樣硬化斑塊根據其穩定性可分為穩定斑塊和易損斑塊，易損斑塊通常指那些容易形成血栓或短期內極可能快速進展的斑塊。易損斑塊的發生機制相當復雜，比較常見的有慢性炎癥、脂質代謝紊亂、氧化應激反應、內皮損傷及血流動力學改變、巨噬細胞凋亡和表型極化等[3]。在晚期動脈粥樣硬化斑塊中，纖維帽破裂是加速斑塊生長的主要因素并經常導致心腦血管意外的發生，Redgrave等[4]進一步將斑塊細分為穩定的、主要穩定的、具有完整纖維帽的不穩定斑塊和纖維帽破裂的不穩定斑塊4 種類型。易損斑塊通常具有薄的纖維帽、富含脂質的壞死核心，其特征有炎癥過程、巨噬細胞浸潤和新生血管形成等，特別是斑塊內出血更容易促使易損斑塊的形成[5]。

2 T 淋巴細胞和巨噬細胞在易損斑塊中的重要作用

T 細胞和巨噬細胞在易損斑塊中大量存在，不同功能狀態的T 淋巴細胞和巨噬細胞之間必然存在復雜的細胞間相互作用，共同參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成及心腦血管意外的發生。

2.1 T 細胞

斑塊中的T 細胞主要為CD4+和CD8+T 細胞，其細胞亞群較血液中更為活躍，CD8+T 細胞占比更多，其可被不同程度激活而后衰竭，所以斑塊內表現為活化和衰竭的T 細胞亞群并存的局面[6]。長期慢性炎癥刺激可使T 淋巴細胞衰竭，此時T 淋巴細胞失去其強大的效應器功能，并表達多種抑制性抗體，如靶向程序性死亡蛋白 1（programmed death-1，PD-1）、細胞毒性T 淋巴細胞抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4）等[7]。但這一過程是可逆的，為免疫療法提供了可能。Fernandez 等[8]分析信號通路發現γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和PD-1 信號傳導被同時激活，再次證實了斑塊中同時存在激活的、促炎的和衰竭的CD8+T 細胞。此外，在無癥狀斑塊中由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和IFN-γ 配體驅動的CD4+和CD8+T 細胞之間的配體-受體相互作用可能促進炎癥反應。調節性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）具有抗動脈粥樣硬化作用，通過分泌白細胞介素（interleukin，IL）-10、IL-35 和轉錄生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）來抑制炎癥細胞的募集和活化，還可以抑制T 細胞向Th1 和Th17 亞型分化，發揮誘導、維持免疫穩態及免疫耐受的作用[9]，對本質為自身免疫性疾病的動脈粥樣硬化斑塊的穩定頗有益處。另外還能促進膠原合成和平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）增殖，進而增強斑塊穩定性，且該效應是通過誘導巨噬細胞向M2 型分化實現的[10]。由此可見T 細胞在易損斑塊形成過程中發揮了至關重要的作用，且與巨噬細胞密不可分。

2.2 巨噬細胞

巨噬細胞積聚在動脈粥樣硬化累及的動脈壁內是一種常見的現象，巨噬細胞的表型很大程度上影響了疾病的未來走向。炎性巨噬細胞M1 分泌促炎因子促進動脈粥樣硬化的發展及破壞斑塊穩定性，抗炎巨噬細胞M2 則對動脈粥樣硬化斑塊有保護作用，兩種表型的轉化趨勢受斑塊微環境中多種因子調節，如Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLR)、細胞因子、氧化脂質等會使斑塊巨噬細胞的極化偏向促炎M1 表型且遠離抗炎M2 表型[11]。Huang 等[12]在小鼠體內發現，巨噬細胞中TLR2 和TLR4 信號傳導在轉錄因子Sub1 介導下發揮促炎和促動脈粥樣硬化作用。M2 型巨噬細胞能延緩斑塊發展，由CD206 標記的2 個巨噬細胞亞群（CD64+HLADR+CD206hi、CD64+HLADR+CD206lo）組成，約占斑塊巨噬細胞的47%[8]。細胞外基質降解往往會導致斑塊不穩定，然而巨噬細胞在上調人基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1（human tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1），減少細胞外基質降解的同時，卻降低了斑塊穩定性[8]，可能是M1 和M2 型巨噬細胞共同作用的結果。研究表明，當動脈粥樣硬化進展到晚期時，除出現特異性臨床表現外，心肌梗死及腫瘤相關的一種血清長鏈非編碼RNA-MIAT 的表達也會出現異常升高，而抑制MIAT 基因表達有助巨噬細胞清除凋亡細胞，減弱動脈粥樣硬化的進展，減少壞死核心的大小，并增加斑塊的穩定性[13]。此外，miR-149-5p過表達會通過調控靶向組蛋白去乙酰化酶4 及神經肽2 來抑制血小板衍生的生長因子BB 觸發的血管平滑肌細胞的增殖、入侵和遷移[14-15]。生物信息學分析預測miR-149-5p 在circDHCR24 的3'-UTR 具有互補的結合位點，熒光素酶報告基因實驗和RIP 實驗進一步驗證了circDHCR24 在人主動脈血管平滑肌細胞中作為miR-149-5p 的海綿[16]。Ye 等[17]研究發現，MIAT作為微小RNA（micro RNA，miRNA）海綿，通過海綿作用于miR-149-5p，正向調節抗吞噬分子CD47的表達，進一步確定了巨噬細胞MIAT/miR-149-5p/CD47 通路也是動脈粥樣硬化斑塊發展過程中的關鍵因素。研究表明，含有大量巨噬細胞的頸動脈勻漿中存在大量基質金屬蛋白酶降解基質，形成擴張性動脈重塑，最終導致斑塊易損的風險提高[18]。

3 循環生物標志物在易損斑塊中的作用機制

3.1 腫瘤壞死因子受體家族相關蛋白和干擾素調節因子-5

一項以小鼠為實驗對象的研究中，腫瘤壞死因子受體家族相關蛋白（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）的缺陷會導致單核細胞聚集障礙，活性氧產生受限，及巨噬細胞數量減少，還會抑制線粒體功能、免疫和炎癥通路，使巨噬細胞促進炎癥的能力下降，從而減少易損斑塊形成，反之則促進[19]。小鼠的GITR 免疫反應模式與人類相似。此外，研究發現干擾素調節因子-5（interferon regulatory factor 5，IRF-5）與整合素CD11c 在基因表達水平、免疫陽性斑塊面積高度相關，特別是它們的蛋白表達有共同的定位，主要在斑塊的肩部區域[20]。IRF-5 誘導的CD11c+巨噬細胞可通過下調橋接分子Mfge8-αvβ3 整合素通路來降低胞吐能力，從而增加斑塊及壞死核心的大小[21]。故GITR 和IRF-5也是引起動脈粥樣硬化易損斑塊的一個機制。

3.2 幾丁質酶3 樣蛋白1

幾丁質酶3 樣蛋白1(chitinase-3-like 1，CHI3L1)是一種分泌型糖蛋白，屬于糖苷水解酶家族18 的一員，其表達水平以往常作為反映肝纖維化程度的關鍵指標。近年來研究關注的重點多為炎癥、腫瘤相關巨噬細胞活化、血管生成等[21]。與此同時，CHI3L1對頸動脈斑塊的影響近些年也受到了廣泛關注，其作用機制比較復雜。一方面，CHI3L1 在有癥狀的頸動脈粥樣硬化患者的血清中較健康人群含量增多，該現象可能為環境適應性反應，旨在阻止血管平滑肌細胞發生表型轉換，將其維持在分化狀態，從而達到穩定斑塊的效果[22]。進一步研究將其確定為一種新的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型調節劑，高水平的CHI3L1 使腫瘤抑制基因（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）表達下降，產生下游抑制效應，降低VSMCs 上的LGALS3 和IL6、IL1β 的表達，防止VSMCs 產生不良生物學行為，包括細胞凋亡和表型向“巨噬細胞樣”狀態轉變[23]。另一方面，CHI3L1 介導動脈粥樣硬化斑塊內新生血管的形成，誘發斑塊內出血，增加斑塊不穩定性。試驗證明CHI3L1 增強了人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的遷移、成管和斑塊內新生血管形成，且至少部分是由其細胞膜受體白細胞介素-13 受體α2 通過ERK 和AKT 信號通路介導的，因為該作用可被絲裂原活化蛋白激酶激酶和磷脂酰肌醇3-激酶的抑制劑顯著抑制[24]。CHI3L1 對頸動脈粥樣硬化斑塊的影響是雙重的，其在斑塊發生發展過程中必然發揮了一定的促進作用，同時對于晚期易損斑塊形成后又起了相當一部分保護作用。因此，CHI3L1不僅是一個可以預測不穩定動脈粥樣硬化斑塊存在的生物標志物，還可以作為斑塊穩定性的調節因子。隨著研究的進展，CHI3L1 在血管生物學上相互矛盾的作用機制解釋清楚以后，將是一個理想的治療靶點。

3.3 纖維蛋白原和纖維蛋白原γ'

纖維蛋白原（fibrinogen，Fib）在上級凝血因子作用下形成纖維蛋白網附著在血管內皮細胞表面，誘導血栓形成，進而沉積在血管內壁上加速粥樣硬化斑塊的進展。尤其在血漿脂蛋白促進血小板活化和聚集、穩定纖維蛋白網結構等作用下，進一步促進易損斑塊的發展，大幅提高斑塊破裂風險[25]。Fib與白蛋白的比率 (fibrinogen to albumin ratio,FAR)是一種新型炎癥和血栓形成標志物，且既往研究表明Fib 和低血清白蛋白水平與急性缺血性卒中的不良預后有關，故有學者將之應用于急性腦梗死預后的預測，結果顯示 FAR 值≥0.077 提示急性腔隙性腦梗死后3 個月的不良結局[26]。纖維蛋白原γ'（Fibγ'）是纖維蛋白原的一種亞型，具有抗凝血特性。已有報道稱Fibγ'可以增加中國人群缺血性腦卒中的易感性[27]，但頸動脈易損斑塊的作用機制一直未經明確闡述。而最新研究發現，Fib 和Fibγ'水平較高的患者與水平較低的患者相比，斑塊內出血體積和富含脂質的壞死核心體積顯著降低，且不受C 反應蛋白的影響[28]，說明Fib 和Fib γ'在易損斑塊的發展中具有保護作用。這些研究讓我們看到了纖維蛋白原在頸動脈易損斑塊形成中的重要性。

3.4 纖維膠凝蛋白

最新研究發現，纖維膠凝蛋白（ficolin，FCN）與炎癥標志物如髓過氧化物酶、基質金屬蛋白酶8、基質金屬蛋白酶9、細胞間黏附分子-1、骨橋蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶等表達水平呈正相關，在明視野顯微鏡下可見FCN 主要存在于斑塊中富含膽固醇晶體的壞死核心區域[29]。FCN -2 與動脈粥樣硬化患者中預測主要不良心血管事件的炎癥蛋白——骨橋蛋白及斑塊下游的巨噬細胞和中性粒細胞呈正相關，與動脈粥樣硬化的保護因子高密度脂蛋白膽固醇呈負相關，但與SMCs 呈負相關，FCN-2 介導斑塊內免疫細胞募集和炎癥過程，最終導致斑塊易損[30]。還有一個奇怪的現象，動脈粥樣硬化患者的FCN-2 血清水平高于健康人群，但在易損斑塊患者血漿中可見FCN-2 表達水平明顯下降[29]，據此可以推測FCN-2 參與了動脈粥樣的過程并不斷積累，同時在疾病晚期的斑塊侵蝕階段被炎癥不斷消耗。此外，FCN-1 和FCN-3 也與炎癥發生、易損斑塊的形成密切相關，如FCN-3 表達水平的高低與頸動脈易損斑塊形成呈負相關[31]。甚至在2 型糖尿病患者中，FCN-3 的升高可獨立預測斑塊形成的風險[32]。一項回顧性分析顯示原發性高血壓患者血清FCN-3 越低，頸動脈內膜中層的厚度隨之增加，進而加速心血管疾病發展[33]。

3.5 血清信號素7A

血清信號素7A（semaphorin 7A，Sema7A）對動脈粥樣硬化斑塊的影響比較復雜，在不同的器官中有不同的促炎和抗炎作用[34]。Sema7A 通過激活mTOR和AKT2 信號通路誘導巨噬細胞趨化，激活巨噬細胞向M2 表型極化，促進白細胞清除，從而緩解炎癥[35]。在頸動脈中主要以促炎為主，其升高與急性動脈粥樣硬化血栓性卒中發病風險獨立相關[36]。Sema7A 缺乏可減少T 細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的積累，并增強斑塊穩定性[37]。最新研究發現，含Sema7A 基因的高脂飲食小鼠的左頸動脈血流紊亂促進了內皮細胞Sema7A 和細胞黏附分子的表達以及白細胞黏附和斑塊形成，但是阻斷已知的Sema7A 受體——β1整合素或抑制局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）則顯著降低人臍靜脈內皮細胞黏附分子的表達和單核細胞的黏附，表明Sema7A 通過β1整合素依賴性方式介導內皮功能障礙，促進易損斑塊的形成[38]。Song 等[39]將HUVECs 暴露于50μg/ml ox-LDL 來模擬高脂血癥誘導的內皮細胞損傷，結果顯示HUVECs 活力顯著降低，IL-1β、IL-6 和趨化因子配體2 等炎癥因子被誘導產生，細胞黏附因子（cell adhesion molecules-1，CAM-1）和血管細胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達水平顯著上調，Sema7A 的敲低可以消除上述結果，然而β1 整合素的過表達又可以逆轉Sema7A 敲低的效果。因此，Sema7A 敲低可以抑制炎癥、細胞凋亡和內皮細胞間質化，起到一種保護效果，且該效果可被β1 整合素的過表達所抵消。內皮-間質轉化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）在動脈粥樣硬化中是一種常見的變化，Hong 等[40]發現Sema7A 通過膜受體β1 整合素上調轉錄因子ATF3，導致TGF-β2 轉錄增強和TGF/Smad3 信號通路激活，從而誘導EndMT，加速動脈粥樣硬化的進展。因此，Sema7A 和β1 整合素可以作為治療動脈粥樣硬化中內皮細胞損傷和功能障礙的潛在靶點。

4 小結與展望

頸動脈易損斑塊的發病機制比較復雜，想要更加精準地了解斑塊發生發展的全過程，仍需在未來繼續不斷總結經驗及深入探究。迄今為止，對于已經明確的可以作為易損斑塊標志物的生物分子，大部分可作為心腦血管意外的獨立危險因素，用于預測發生心腦血管意外的概率，但目前尚未在臨床上廣泛應用。另外，目前臨床上藥物治療動脈粥樣硬化斑塊仍以阿司匹林及他汀類藥物為主，主要起到延緩斑塊進展的作用，期望今后可發現新的治療靶點，進而研發出逆轉斑塊進展的新一代靶向治療藥物，減少由動脈粥樣硬化斑塊引起的心腦血管意外。