干細胞再生工程技術與關節軟骨缺損修復

呂子豪，周明旺*，王曉萍，吉星，李盛華

（1 中國融通醫療健康集團有限公司淄博一四八醫院，淄博 255399；2 甘肅中醫藥大學，蘭州 730000；3 甘肅省中醫院，蘭州 730050）

關節軟骨由于缺少血管、神經及淋巴系統[1]，且軟骨內沒有巨噬細胞，損傷后壞死和凋亡的殘余物無法清除，抑制組織再生，因而輕微的軟骨磨損都會造成不可逆的傷害。關節脫位和半脫位、剝脫性骨軟骨炎與慢性退行性改變都會導致關節軟骨損傷，這種損傷可單獨發生，也可能伴隨肢體畸形、半月板、韌帶損傷和骨缺損等[2]，因此關節軟骨缺損的修復成為骨關節損傷及退行性病變中所面臨的一個巨大的難題。抗炎藥、關節內注射及矯形支具的使用僅能控制現有的癥狀，很難達到良好的療效。

傳統的軟骨修復手段有軟骨鉆孔術[3-4]、微骨折術[5-6]、骨膜移植、自體骨或同種異體骨移植[7-9]等，新興的工程軟骨組織[10]、水凝膠復合物輔助修復[11-12]等組織工程技術也逐步被應用于軟骨修復治療之中。隨著干細胞研究的快速發展，脂肪組織、骨髓和臍帶等分離的間充質干細胞（mesenchymal stem cell,MSCs）在軟骨修復中顯示出更為廣闊的前景。

軟骨細胞無法產生足夠的功能性基質以修復受損軟骨是骨關節炎（osteoarthritis, OA）的顯著特征之一[13]。以胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESC）、神經祖細胞、MSCs 和造血干細胞等[14]為研究對象的再生醫學通過細胞療法、組織工程和基因療法修復人體功能失調、受損或缺失的細胞、組織和器官，以重現機體正常功能[15]。其中，MSCs 憑借其高增殖能力、軟骨分化能力和免疫抑制活性在OA 軟骨損傷的再生中發揮了重要作用[16]。目前，在實驗動物和人的研究中，以干細胞為基礎的療法在軟骨修復方面已具有一定療效，干細胞與骨組織工程技術相結合也逐步應用于臨床，例如3D 打印骨組織工程支架的技術通過負載干細胞起到對骨組織結構修復及誘導干細胞的定向分化和增殖[17]。

1 間充質干細胞的軟骨修復作用

MSCs 作為具有中胚層和神經嵴起源的多能基質細胞，可分化成多個細胞譜系并發揮旁分泌作用[18]，給包括骨骼疾病在內的各醫學領域帶來了許多希望。成骨細胞、體外的軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞等通過骨髓、脂肪組織、肌肉、臍帶等的MCSs分化而來[19]，進而修復或重建受損骨骼組織。在軟骨修復中，骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）、脂肪干細胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）、臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs）[20]等都顯示出了修復關節軟骨的潛力，但它們又有著各自的優勢。

1.1 骨髓間充質干細胞

BMSCs 是組織工程軟骨構建的理想種子細胞之一[21]，它取材方便、易于培養，具有分化為軟骨細胞的潛力，并通過分泌生物活性因子以防止軟骨的降解。BMSCs 通過多種方式參與軟骨的修復，一種載有BMSCs 的3D 生物打印多層支架通過促進膠原蛋白II 和抑制股骨滑車骨軟骨缺損中的白細胞介素1β 來促進軟骨形成[22]，并顯著改善大鼠受傷腿的地面支撐力、爪抓地力和步行步態參數等。TGF-β1或/和CDMP1 誘導BMSCs 表達膠原蛋白II、聚集蛋白聚糖和Sox9[23]，能增強細胞遷移，抑制細胞凋亡，并減輕兔喉軟骨缺損，降低特異性軟骨基質標志物水平。一種負載BMSCs 的新型動態納米復合微凝膠組件，可臨床注射，其組織粘附性、微孔性及受控藥物釋放更加優越，可為軟骨修復提供更優的微環境[24]。有學者[25]發現使用熱敏甘油磷酸酯（GP）研發與聚賴氨酸改性殼聚糖聚合物（SF/PCS）共混的大分子絲素蛋——TGF-β1-SF/PCS 可注射水凝膠與BMSCs 有著良好的生物相容性，在軟骨修復的前景中較好。

除了BMSCs 有促進關節軟骨再生的潛力[26]，其衍生的外泌體（BMSC-Exos）也可以對軟骨的再生起到促進作用。BMSC-Exos 通過人臍帶沃頓氏膠促進巨噬細胞向M2 表型的極化，抑制炎癥反應進而促進軟骨再生，減弱IL-1β 對軟骨細胞增殖和遷移的抑制作用[27]。不僅如此，BMSC-Exos 還可減輕軟骨損傷，減少骨贅形成和滑膜巨噬細胞浸潤，抑制M1巨噬細胞的產生并促進M2巨噬細胞生成[28]。M2巨噬細胞可以產生精氨酸酶-1（arginase-1, ARG-1）和促軟骨形成細胞因子（如IL-10、IL-1RA 和TGFβ），BMSC-Exos 通過促進M2 巨噬細胞的形成進而加速軟骨修復進程[29]。

由上可知，BMSCs 在軟骨修復中多通過生物工程組織架或者生物載體化合物等方式發揮其對關節軟骨的修復作用，比較突出的優點是可臨床注射及受控藥物釋放性優越，為藥物結合干細胞治療軟骨缺損提供了較為可靠的載體。研究者需進一步明確其作為藥物載體的藥效釋放曲線，以及機體的免疫排異反應情況。此外，由于制備BMSCs 的材料和工藝較為復雜，臨床應用仍受到一定限制。

1.2 脂肪干細胞

雖然缺氧狀態下BMSCs 顯示出致密的軟骨形成顆粒和更高的軟骨形成潛力[30]，但在OA 的治療中，ADSCs 相比于BMSCs 更容易獲得[31]，它來源更廣泛、獲取更便捷、免疫原性較低，可以產生最佳數量的軟骨細胞修復軟骨缺損[32]，因而廣泛用于動物實驗和臨床實踐中。

ADSCs 往往通過生物結合技術發揮對軟骨修復的作用。ADSCs 不僅可改善膝關節和距骨骨軟骨局灶性缺損的軟骨再生修復[33]，還能作為顱面軟骨缺損或畸形修復的種子細胞[34]。ADSCs 與軟骨細胞外基質通過組織工程構建軟骨復合物，成功修復豬膝關節軟骨缺損[35]。Ma 等[36]通過將ADSCs 加入含TGF-β3 的培養基中與軟骨細胞共培養，能促進細胞增殖，增強ADSCs 的軟骨分化作用，表明ADSCs 和軟骨細胞與TGF-β3 的顆粒共培養可以構建大量軟骨。ADSCs 衍生的細胞外囊泡（extracellular vesicle,EVs）與殼寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）結合可逆轉IL-1β 對軟骨細胞活力和遷移的抑制，降低細胞凋亡，促進軟骨損傷的修復，并改善OA 癥狀[37]。ADSCs 還可通過釋放多種旁分泌因子和EVs 來維持自我更新和增強多分化潛能，從而修復受損的軟骨[38]。另一項研究發現，有雙皮質素（doublecortex,DCX）表達的ADSCs 可增加軟骨組織中生長分化因子5（growth and differentiation factor, GDF5）和母體蛋白2 的表達，顯著增加軟骨的修復，可用于治療局部軟骨損傷的軟骨組織中[39]。

由此可見，ADSCs 不僅通過釋放相關因子改善軟骨的修復，還可以作為種子細胞在軟骨修復中起到作用。相比于BMSCs，ADSCs 在獲取性及免疫原性方面更為優越，可一定程度上解決制備可修復軟骨的干細胞材料和工藝較為復雜的問題，減少機體可能發生的排異反應。

1.3 臍帶間充質干細胞

人臍帶間充質干細胞系（hUCMSCs）與人臍帶血間充質干細胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs）具有比其他干細胞更高的增殖率、更好的穩定性和更大的成軟骨潛力[40]，它在人體[41]和動物體內[42]都表現出了低免疫原性[43]及高增殖率[44]，更重要的是由于其來源于臍帶，采集過程無創，干細胞供應也更為充足[45]。

在一項針對兔軟骨缺損的實驗中[46]，hUCBMSCs 不僅和兔骨髓干細胞（rBMMSCs）有著相對一致的治療方向，而且在軟骨缺損修復、組織學分析及生物力學測試中更優于rBMMSCs的作用，對兔軟骨修復起到了更好的效果。利用UCMSCs 治療膠原誘導性關節炎大鼠（CIA）的實驗表明，與未治療的CIA 大鼠相比，UCMSCs 治療CIA 大鼠的軟組織僅輕微腫脹，關節軟骨破壞較少，滑膜增生亦不明顯，炎癥細胞浸潤顯著減少，且UCMSCs 還通過降低破骨細胞前體的基因表達來減少CIA 大鼠的破骨細胞生成，從而使軟骨缺損自發修復不受抑制[47]。由于hUCB-MSC 在關節軟骨中的治療優勢，新興干細胞療法中將其以復合物的形式投入使用，一種同種異體hUCB-MSC與透明質酸水凝膠復合成的Cartistem干細胞藥物，用于OA 受損部位的軟骨修復療效明顯[48]。針對老年患者，hUCB-MSC 和4%透明質酸鹽復合物（UCB-MSC-HA）的使用在軟骨修復等級及疼痛功能改善程度等方面優于微骨折術[49]。碘乙酸單鈉（MIA）通過Caspase 3 信號通路誘導細胞凋亡，hUC-MSCs 不僅可以幫助經MIA 處理的軟骨細胞減少細胞凋亡，還可以促進透明軟骨再生及損傷的修復，進而起到關節軟骨保護與修復作用[50]。hUCMSCs 與生物工程結合也逐步被應用，利用沃頓膠（WJ）和硫酸軟骨素（CS）復合支架的三維多孔結構優勢負載hUCMSCs 在小鼠軟骨修復中也展現出了抑制免疫排斥和誘導宿主免疫耐受的能力，且修復后的組織與周圍正常組織融合良好，創面光滑完整[51]。

與BMSCs 的外泌體類似，人臍帶間充質干細胞小細胞外囊泡（hUCMSC-sEVs）同hUCMSCs 都可以顯著影響炎癥環境中的軟骨細胞活性和基質重塑過程，經過劃痕試驗表明hUCMSC-sEVs 增強了軟骨細胞的遷移，且與hUCMSCs 相比更有效地增加軟骨細胞的運動性，修復的關節面也更為光 滑[52]。

作為新興干細胞療法中的一員，hU-MSCs 因其增殖性和穩定性更強，且其采集過程無創、簡便而在治療中被更多的選擇。hUCMSCs 不僅可以促進軟骨的再生，還影響破骨作用，在軟骨修復等級及疼痛功能改善方面也優于普通手術治療。

2 胚胎干細胞

胚胎干細胞（ESC）來源于囊胚期的內細胞團，具有無限增殖和胚層分化的潛力，一直是組織工程和再生醫學研究的重點。有研究發現[53]，hESC 衍生的軟骨細胞與膜結合產生的BMP-2 等分泌蛋白可以促進BMSCs 誘導關節軟骨形成，并且經該結合物處理后的軟骨缺損部位在生物力學方面表現出了優于僅膜處理的軟骨缺損部位，瞬時彈性模量也更高，產生的修復組織更類似于天然軟骨，可長期修復缺損的豬透明軟骨的功能。Gardner 等[54]發現hESC 衍生的關節軟骨除修復大鼠滑車關節軟骨外，單個軟骨植入物還有可能促進新軟骨下骨的生成。來自hESC的軟骨形成細胞在小鼠皮下植入后保留了穩定的軟骨形成表型[55]，即使植入的細胞和小鼠宿主細胞在區域上有界限，但在基底和側面與宿主組織結合良好。其中一部分植入物經歷了類似于軟骨內骨化的重塑過程，這也表明了單一軟骨植入物不僅可以修復關節軟骨，還可能促進新軟骨下骨的生成[54]。在植入裸鼠髕骨溝的骨軟骨缺損處時，與軟骨形成相關基因表達上調，促進了軟骨修復[56]。源自人ESC的軟骨細胞對損傷的軟骨進行修復后，I 型膠原蛋白染色情況與天然軟骨類似，且與僅植入纖維蛋白的對照組相比，軟骨形成細胞的修復得到了顯著改善[57]。這些研究表明了缺損的軟骨在植入hESC 衍生的軟骨細胞后，通過增強的軟骨形成起到修復缺損軟骨的作用。

盡管如此，從hESC 中獲得功能性軟骨細胞[58]仍較為困難，并且其牽扯到的倫理問題也很突出，免疫排斥反應也較強，若要應用于人體，必須進行軟骨關節炎癥程度的評估和其他全身性疾病的篩查或排除[53]，這使得ESC 在臨床上的應用受到了較大限制。

3 誘導多能干細胞

誘導多能干細胞（iPSC）通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞，與原代軟骨細胞的間接共培養可以直接誘導軟骨細胞的形成[59]。Guzzo 等人[60]研究發現iPSC 可增強軟骨形成能力，且較其他細胞相比更為優越。iPSC相比于ESC，來源限制就相對小很多，并且iPSC 可以克服形成骨骺或肥大軟骨的問題[58]。iPSC 傾向于產生具有胚胎特征的細胞，這將為獲得具有類似軟骨自我修復活性的細胞提供機會[61]。iPSC 來源的人骨骼干細胞（hSSC）會向軟骨偏向分化[62]，為軟骨的修復提供支持。免疫原性方面，iPSC 具有一種免疫原性特性，而這種特性在干細胞進行軟骨修復時發揮一定的作用[63]，且iPSC 與其他干細胞相比具有更有效的免疫調節作用，從hiPSC 獲得的軟骨祖細胞也表現出MSCs 的免疫表型特征[64]。通過iPSC（或ESC）的單層培養物首先分化為中內胚層，然后進一步分化為軟骨形成培養物，這是最接近自然發育的誘導人類軟骨分化的方法[65]。

雖然iPSC 沒有ESC 的倫理限制和免疫原性影響，但不可忽視的一點就是其臨床應用成本高昂，而且很難制備無遺傳修飾的iPSCs，不僅如此，iPSCs臨床應用的安全性也有待研究。這些問題限制了iPSCs的發展，但同時也為我們的研究指明了方向。

4 小結與展望

軟骨缺損的治療和修復作為世界性醫學難題，一直困擾著我們，如何對軟骨進行精準修復還未有十分明確的方案，應用干細胞治療關節軟骨缺損更是學者們研究的焦點。BMSCs 取材方便、易于培養；ADSCs 與BMSCs 相比來源更廣泛、獲取便捷、免疫原性較低；hUCMSCs 與BMSCs 相比有更高的增殖率、更好的穩定性；ESC 因受限于倫理問題，獲得性較差，加上免疫排斥反應，限制其在軟骨修復中的應用；iPSC 克服了BMSCs 骨骺形成及肥大軟骨生成問題，但其臨床成本過于高昂。除此之外，滑液來源的間充質干細胞（SF-MSCs）[66]、外周血來源的祖細胞[67]也屬于干細胞治療軟骨缺損的一個范疇。如何為關節軟骨缺損的醫療修復提供廉價、便捷、優效的方案，克服干細胞來源問題，擺脫干細胞應用于疾病治療時遇到的技術瓶頸，避免干細胞在應用過程中產生的免疫排斥反應，以及結合生物組織工程學后怎樣保證干細胞穩定性的問題，細胞應用于人體的生物安全性問題，都是需要我們做進一步研究及討論的難點。

我們應該結合再生醫學、生物工程學、組織工程等多個學科進行干細胞的應用研究，從生理層面、病理層面及對軟骨修復的效率等多方面開展人體及動物實驗研究，為干細胞在軟骨修復中的應用提供更好的理論技術支持。盡管干細胞的高分化能力給予軟骨修復一定程度的幫助，但因其準確性不佳、價格昂貴，仍無法廣泛投入臨床實踐應用中。軟骨修復輔助蛋白因子受潛在的蛋白質不穩定性的限制，高劑量的蛋白質可能帶來不利于機體的副作用，水凝膠復合物就此應運而生。干細胞通過結合水凝膠復合物，從而在軟骨修復等疾病中克服細胞自身生理特性的局限與蛋白質不穩定性的限制，這項技術給了我們一定的啟發，隨著組織工程技術[68]、細胞膜片技術[66]、3D 打印工程支架技術[69]等多種技術的發展，干細胞結合上述幾項技術應用于軟骨修復可以避免干細胞不同種類本身所帶來的局限性，提高軟骨修復效率，降低損傷性和排異性，通過選擇最優種類干細胞結合相關生物組織工程學技術而實現利用性最大化。

目前，我國實施“健康中國戰略”，干細胞技術與再生醫學結合應用是落實該戰略部署的一個重要武器之一，應用于軟骨損傷的修復治療前景無限，但研究對象多為動物，在人體內實驗方面還較為空白，是我們進一步研究的方向和重點。