內質網應激-自噬在皮瓣缺血再灌注損傷中的作用及中藥干預

朱克玉，宋淵*，沈稼軒，喬靖，韓瀟，王恒杰

（1 甘肅中醫藥大學，蘭州 730030；2 甘肅省中醫院，蘭州 730050）

隨著工業和農業化進程，復雜的手工操作，各類軟組織缺損傷逐漸增多。一期閉合傷口，降低感染率，恢復其良好的外形及功能是一個難題。皮瓣移植技術是解決此類損傷最常用、最有效的辦法。缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion, I/R）是造成皮瓣移植術后皮瓣壞死的主要原因，是皮瓣從供區轉移至創面的過程中，組織經歷缺血、重新獲得血液灌注或供氧后所產生的一系列損傷[1]。皮瓣壞死后需行復雜的重建修復手術，給患者帶來心理負擔和經濟負擔[2]。目前研究發現I/R 的主要病理機制有炎癥反應、氧化應激、鈣超載、鐵死亡、細胞凋亡等[3]。這些體外或體內應激性刺激造成內質網腔的強氧化環境被破壞，導致內質網功能出現障礙，產生突變的蛋白質或者蛋白質二硫鍵不能形成，引起內質網中未折疊或錯誤折疊蛋白的積聚，誘發內質網應激 （endoplasmic reticulum stress, ERS)[4]。細胞為了消除內質網中積聚的未折疊或錯誤折疊的蛋白啟動未折疊蛋白反應（unfloded protein response,UPR）[5]。細胞自噬是伴隨UPR 發生的另一種細胞保護機制, 幫助降解內質網中積聚的未折疊或錯誤折疊蛋白，降低ERS，維持內質網定性，保護細胞存活[6,7]。近年來研究表明[8,10]，I/R 與ERS 誘導的自噬密切相關，中醫藥干預ERS-自噬成為防治I/R 損傷的新方法。本文就近年來關于該方面的研究進展作一綜述，旨在為I/R 防治尋找新的潛在干預靶點。

1 內質網應激與自噬

內質網在真核細胞內具有重要的生理功能，能協調蛋白質折疊，脂質合成和鈣儲存與釋放，具有很強的活躍性，當受到缺血缺氧、未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網中大量堆積、Ca2+平衡破壞、蛋白質糖基化抑制等內源或外源因素刺激時均可導致內質網的功能受損，從而引起ERS[11]。細胞自噬是真核生物進化過程中高度保守的一類降解途徑，通過自噬體將蛋白質等生物大分子、線粒體等細胞器以及微生物等回收至溶酶體形成自噬溶酶體，再降解為氨基酸、單糖等小分子，實現物質循環再利用的動態過程[12]，因此，ERS 和細胞自噬是兩個獨立的生物過程。越來越多的研究表明[13,14]，二者存在相互作用，ERS 可引發自噬，自噬通過降解積聚的錯誤折疊蛋白質來減輕內質網壓力。當ERS 持續較長時間時，內質網功能紊亂，細胞激活UPR 信號通路以應對環境變化，恢復利于蛋白質折疊的內質網環境，維持細胞內環境穩定。若ERS 不能逆轉，UPR 激活細胞自噬甚至誘發細胞凋亡，以實現內環境的穩定[15]。葡萄糖調控蛋白（glucose-regulated protein78, GRP78）作為ERS 標志蛋白，對于ERS 誘導自噬發生非常重要，在發生ERS 時，GRP78 的表達量顯著增高，大量積聚的錯誤折疊或未折疊蛋白優先與GRP78 結合，導致GRP78 與UPR 的類PKR 的內質網激酶（PKRlike endoplasmic reticulum kinase, PERK）、肌醇需求激酶1α（inositol requiring enzyme 1α, IRE1α）、轉錄激活因子6（activating transcription factor-6, ATF6）3種感受器分離，激活UPR 信號轉導途徑，促進蛋白質正確折疊和錯誤折疊蛋白降解，以恢復內質網環境的穩定[16,17]。可見，ERS 和細胞自噬是細胞在程度不同的刺激因素下產生的適應性反應，二者相互作用，共同調節細胞命運。輕度的ERS 引起的UPR是一種防御機制，維護細胞和機體的穩態。持續發生的ERS 則能誘導細胞自噬，發揮類似UPR 的補充機制，進一步降解異常蛋白質和受損的內質網等細胞器，并通過負反饋機制抑制ERS，減弱環境刺激對細胞的影響，維持細胞穩態[18]。

2 內質網應激在缺血/再灌注損傷中的作用

I/R 是皮瓣不可避免的一個極其復雜的病理、生理過程，其機制包括缺血和再灌注兩部分[19]。缺血過程會導致三磷酸腺苷（ATP）減少、細胞內代謝性酸中毒、線粒體和細胞內鈣超載等；再灌注過程會引起活性氧、氧化應激、炎性反應、自身免疫反應等[20,21]。因此，全面認識I/R 的機制，尋找多方法、多渠道的干預措施才能預防和治療I/R 損傷，并能減少皮瓣術后的并發癥[22]。研究表明[23]ERS 參與I/R損傷過程，ERS 預處理可以提高組織缺血再灌注損傷的耐受性，其可能的效應機制[24,25]：一方面，上調GRP78 蛋白表達增強內質網處理未折疊蛋白能力；另一方面，抑制 CHOP 信號途徑激活，減少細胞凋亡、減輕組織炎性反應。GRP78 和CHOP 是內質網應激途徑的兩個經典標志物[26]。ERS 早期，細胞通過啟動未折疊蛋白反應特異信號系統，促使GRP78表達上調，并與內質網中錯誤折疊的和未折疊的蛋白結合，恢復蛋白質正確構象，維持內環境穩定。但在過久的ERS 情況下CHOP 被大量誘導表達，從而啟動CHOP 介導的細胞調亡[27]。因此，通過抑制ERS 反應，可以有效預防細胞凋亡，使I/R 病理進程得到抑制。以上研究提示以ERS 為干預靶點，可能為阻斷皮瓣缺血誘導I/R 損傷提供一種新方法。

3 自噬在缺血/再灌注損傷中的作用

自噬是細胞在溶酶體內消化細胞質的現象，其主要功能是清除和回收錯誤折疊或損壞的蛋白質和細胞器，這與細胞的存活和凋亡密切相關[28]。自噬是一把“雙刃劍”，在皮瓣缺血階段，自噬降解非功能性胞質蛋白，為關鍵生命活動提供關鍵營養，從而抑制細胞凋亡和壞死[29]。最新研究表明[30]，自噬是減少缺血后損害的必要條件，自噬過程可通過去除受損的線粒體來限制NLRP3 炎性小體（inflammasome）的活化。但是，過度自噬在再灌注階段可能會對皮瓣產生負面影響。研究顯示[31]，中藥可能通過缺血期誘導自噬發生，再灌注期抑制自噬來發揮抗I/R 損傷的作用。I/R 通過抑制自噬體的形成，導致氧化應激和細胞凋亡增加[32]。因此，自噬是I/R損傷的重要病理機制之一，利用自噬的雙重作用及特點和功能，通過藥物干預細胞自噬，進而抑制炎癥、細胞凋亡和氧化應激，促進皮瓣成活，可能是未來防治皮瓣I/R 損傷的主要策略。

4 中藥干預內質網應激-自噬防治I/R 損傷

近年來隨著I/R 損傷相關研究的不斷深入，中藥單體、提取物及復方通過干預內質網-自噬相關因子的表達，提高皮瓣成活率成為相關領域的研究熱點。中藥以其多靶點、效應廣，副作用少等優勢在I/R 損傷治療藥物中的地位日益提高。隨著分子生物學技術的成熟，其治療機制研究也日益增多。本部分總結近年來內質網標志細胞因子GRP78、CHOP，自噬相關研究的熱點或關鍵作用的細胞因子LC-3、beclin-1、mTOR 和P62，以及中藥的調控作用與機制。

4.1 中藥干預內質網應激

4.1.1 中藥單體和中藥

Pan 等[33]研究發現白藜蘆醇可以上調GRP78，下調p-PERK 和CHOP 蛋白的表達，促進內質網結構和功能的恢復，減輕細胞損傷，從而減輕I/R 損傷。代小蘭等[34]發現白芍總苷干預能夠顯著降低大鼠腦組織GRP78、p-PERK、CHOP、NF-κB、Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3 蛋白表達，抑制過度ERS 介導達到抑制細胞凋亡，對I/R 損傷起保護作用[35,36]。實驗表明，香葉醇降低ERS 相關蛋白PPERK、ATF4、CHOP 和GRP78 和促凋亡蛋白BAX的表達，增加抗凋亡蛋白BCL-2 的表達，減少細胞凋亡，減輕I/R 損傷[37]；柚皮苷顯著抑制 GRP78、CHOP、Caspase-12 和ATF6 蛋白的表達，對I/R 引起的ERS 具有抑制作用[38]；絞股藍苷XVII 顯著降低GRP78、ATF6、CHOP 的表達和PERK 的磷酸化，對ERS 具有抑制作用[39]；黃芪素下調ERS 相關蛋白GRP78 及其下游凋亡介質CHOP 和Caspase-12的表達水平，防止I/R 誘導的損傷[40]；川芷素預處理顯著下調ERS 相關信號分子GRP78，CHOP 和caspase-12 蛋白質水平，上調p-PI3K 和p-AKT 的水平，減輕I/R 引起的損傷[41]；龍血竭灌注可以上調BCL-2 蛋白表達，下調Bax、GRP78、CHOP-1、p-P38、p-JNK-1、pERK 蛋白的表達，減少細胞凋亡，抑制ERS，進而達到抗I/R 損傷的作用[42]。

4.1.2 中藥復方

補陽還五湯是清代名醫王清任的經典方。具有補氣活血通絡之功效。程一升等[43]通過實驗發現補陽還五湯可下調GRP78、PERK、elF2α、ATG12等內質網應激-自噬相關基因的表達改善缺血再灌注損傷。清熱活血湯由黃芩、丹參、赤芍、川芎、紅花等組成，具有清熱解毒、活血化瘀之效。李睿等[44]研究發現清熱活血湯下調Bax /Bcl-2、GRP78、CHOP、P62 的表達，同時上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、FAM134B 蛋白表達，抑制內質網應激及其凋亡通路激活，減輕組織損傷。《金匱要略》中栝蔞桂枝湯具有抗炎、抗氧化應激的作用[45]，可以減少氧化應激、促進Ca2+動態平衡來抑制I/R 損傷引起的ERS與細胞凋亡[46]。陳喆鳴等[47]發現栝蔞桂枝湯治療后可明顯下調 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3，上調Bcl-2 mRNA 的表達，下調ERS 水平，抑制下游凋亡通路的傳導而發揮治療I/R 作用。加味益氣通玄方由黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、水蛭、全蝎九味中藥組成，彭艷等[48]實驗研究發現加味益氣通玄方可以通過抑制GRP78、caspase12 和CHOP 的表達，抑制內質網應激介導的細胞凋亡。

4.2 中藥干預自噬

4.2.1 中藥單體

有研究發現，黃芪甲苷促進細胞活力并平衡Bcl-2 和Bax 表達，降低細胞凋亡率，降低P62 表達，增加LC3II / LC3I 表達，表明黃芪甲苷通過促進自噬程度來下調細胞凋亡，對I/R 損傷起保護作用[49]。實驗證實，葛根素預處理降低beclin-1 的表達和LC3-II/LC3-I 比率，以及p-AMPK 和pS317-ULK1水平，相較之下增加p62、mTOR 和pS757-ULK1 的表達水平，抑制I/R 誘導的自噬，治療I/R 損傷[50]。再灌注后beclin1、LC3 和P62 表達升高，細胞自噬增加；川芎嗪干預后beclin1、LC3 和P62 蛋白表達相對降低，表明川芎嗪可能對細胞自噬有抑制或調節作用[51]。松香素能降低LC3II 和Beclin1 的表達，并增加p62 的水平，減少I/R 大鼠細胞自噬的過度激活[52]。在天麻素預處理的細胞模型中，LC3II 的表達增加，p62 被抑制，表明自噬的誘導增強；同時，串聯熒光監測顯示天麻素預處理增強自噬流量，消除功能失調的線粒體，減少細胞死亡，從而減輕I/R損傷[53]。

4.2.2 中藥復方

活血解毒湯具有清熱解毒，活血止痛之功效。主瘀血阻滯，日久化熱。活血解毒方預處理可降低組織中的自噬：beclin-1 和LC3-II 減少，Bcl-2，p62 和LC3-I / LC3-II 的比率增加，改善組織I/R 損傷[54]。實驗證明，補陽還五湯通過SIRT1/自噬途徑增加beclin 1 和LC3-II 以及減少p62，促進自噬的重要調節因子sirtuin1 (SIRT1) 的表達，顯著增強自噬，減輕I/R 損傷[55]。化濁解毒活血通絡方可明顯降低缺血再灌注后的自噬水平，下調LC3、Beclin1、Atg5 的表達，上調P62 蛋白的表達，有效改善I/R 損傷[56]。清熱化瘀方顯著降低I/R 大鼠組織Nix 及beclin-1、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ表達，抑制線粒體自噬，同時降低ROS、TNF-α 和IL-6 水平，改善大鼠I/R 損傷[57]。桃紅四物湯預處理后自噬標記蛋白LC3-II / LC3-I、beclin1、Atg5 和線粒體自噬標記蛋白Parkin（PINK-1）的表達顯著升高，活性氧、NLRP3 炎癥小體和促炎細胞因子明顯減少，從而保護細胞免受I/R 損傷[58]。

5 總結

皮瓣I/R 損傷是一個復雜的生理病理過程，涉及大量的細胞類型、生長因子和細胞因子，且與內質網標志細胞因子GRP78、CHOP 及自噬熱點因子LC-3、beclin-1、P62、mTOR 等密切相關，在治療I/R 中具有巨大的潛力，中藥可能通過干預ERS-自噬等位點起效。本文重點討論了ERS、自噬在皮瓣I/R 損傷中的作用及中藥對相關因子的調控趨勢，歸納ERS、自噬對皮瓣I/R 損傷的保護作用及相應機制。兩種機制相互協同，相互促進，形成一系列的反應來促進皮瓣的成活。但目前缺乏動物實驗、細胞水平實驗、大樣本的臨床研究及循證數據支持。中藥單體或復方具有高效低毒、多靶點及多通路協調作用的顯著優勢，在本文文獻回顧中，大量中藥單體及復方調控相關因子表達，干預ERS、自噬，減輕I/R 損傷，達到提高皮瓣成活率的目的，但其中蘊藏著龐大而錯綜復雜的調控網絡控制著I/R 的發展轉歸，后期還需通過“網絡藥理學+細胞生物學實驗”等手段對有效成分及作用機制研究，同時進行大樣本臨床隨機對照研究，進而分析中藥治療皮瓣I/R 損傷的優勢所在。