MEBT/MEBO對糖尿病大鼠慢性創面組織miR-126a-3p表達及血管新生的影響

徐媛媛,周安邦,黃光京,陳思蓉,吳標良

(1.右江民族醫學院附屬醫院內分泌科,廣西百色 533000;2.右江民族醫學院研究生學院,廣西百色 533000)

糖尿病慢性創面是由長期糖脂代謝紊亂等全身因素及創面周圍神經病變、血管病變和感染等局部因素共同導致的難治性創面[1-2]。近來,研究者們發現血管新生過程受阻導致中斷會使糖尿病慢性創面血液供應不足,嚴重影響創面機化進程,最終致使糖尿病慢性創面難以愈合[3],miR-126a-3p曾被稱為miR-126-3p或miRNA-126,作為特異性內皮功能生物標志物,能動員造血干細胞并促進血管新生[4-6]。諸多研究證實,皮膚原位再生醫療技術(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)可調控炎癥與免疫因子的分泌,加快成纖維細胞和新生毛細血管的增殖,抑制瘢痕組織的形成,在臨床治療糖尿病慢性創面中取得了良好療效[7-9]。然而,基于miR-126a-3p調控研究MEBT/MEBO促進創面愈合機制十分罕見,因此,筆者從miR-126a-3p角度進一步探討 MEBT/MEBO 促進糖尿病慢性創面愈合的分子機制,為 MEBT/MEBO 的臨床推廣提供更豐富的理論鋪墊。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器濕潤燒傷膏(MEBO,汕頭市美寶制藥有限公司);鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)(北京索萊寶科技有限公司);三氯乙醛水合物(上海麥克林生化科技股份有限公司);miR-126a-3p、U6引物(廣州復能基因有限公司);光學顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司];微量紫外/可見分光光度計[天根生化科技(北京)有限公司];伯樂T100 PCR儀(美國伯樂Bio-Rad公司);羅氏LightCycler96 1.0系統(德國羅氏診斷有限公司)。

1.2 實驗動物將72 只7周齡,體重240～280 g,SPF級Wistar雄性大鼠作為受試對象。該動物購于長沙市天勤生物技術有限公司(許可證號：SCXK[湘]2019-0014)并喂養于右江民族醫學院SPF級實驗動物中心,環境清潔,溫度23～25 ℃,喂養普通飼料,飲用清潔水源,隔天更換墊料。該實驗方案已獲得右江民族醫學院動物倫理委員會批準(批號：2018051501)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型構建適應飼養1 周后開始實驗,隨機將所有在養的大鼠分配到對照組、模型組及MEBO組,每組24只。其中,模型組和MEBO組大鼠參照董方等人[10]實驗性糖尿病大鼠建模方法,禁食16小時后腹腔注射 STZ 45 mg/kg,3天后觀察大鼠一般情況并測量空腹血糖,出現多飲、多食、多尿等典型糖尿病癥狀并且血糖大于16.7 mmol/L則表明糖尿病模型構建成功。此時參照趙京禹等[11]全層皮膚缺損法構建大鼠慢性難愈合創面模型。將大鼠腹腔注射5%三氯乙醛水合物7 mL/kg麻醉,用印章在右側背部印出直徑為20 mm的圓形標記,并沿標記用無菌剪刀剪除其全層皮膚,建成糖尿病大鼠慢性難愈合創面模型。對照組大鼠正常進食飲水,腹腔注射5%三氯乙醛水合物7 mL/kg麻醉,用印章在右側背部印出直徑為20 mm的圓形標記,并沿標記用無菌剪刀剪除其全層皮膚,建成急性創面模型。

1.3.2 創面處理及血糖控制創面造模構建后立即給大鼠換藥,早晚各1次;選用濃度為 0.02%呋喃西林抑菌溶液給各組大鼠清創;MEBO組大鼠依次覆蓋 2 層MEBO紗布(0.2 g/cm2)及2層無菌干紗布并包扎固定;模型組和對照組覆蓋2層生理鹽水紗布及2層無菌干紗布并包扎固定。糖尿病大鼠若血糖值大于33.3 mmol/L則予以長效胰島素皮下注射,每天2次,每次2～4 IU/kg,將血糖控制在16.0 mmol/L左右。

1.3.3 動物及創面肉眼觀每天觀察且記錄所有在養大鼠一般情況及創面愈合情況。造模首次給藥后,分別于治療后第1天、第11天和第18天,隨機在每組中抽取8只大鼠,固定后將刻度尺放置于大鼠創面邊緣,并且用相機拍攝創面,將采集的圖像上傳至Image J軟件并測量創面面積,利用公式計算創面愈合率。愈合率=(初始面積-未愈面積)/初始面積×100%。

1.3.4 創面組織標本采集及處理分別于治療后第1天、第11天和第18天,每組隨機選取8只大鼠,按上述方式麻醉大鼠后,距創緣 0.5 cm 處采集造模區整個創面及周圍組織,而后將大鼠過量麻醉處死。將采集到的組織樣品分為2份,一份放入無酶凍存管中并標記,迅速置于液態氮氣中速凍,后保存到-80 ℃冰箱。另一份放入包埋盒中并標記,迅速浸泡于4%多聚甲醛固定液中。

1.3.5 創面組織病理學檢測及血管計數將各組不同時間點大鼠組織標本固定18小時,再經梯度脫水、透明、浸蠟,并包埋制成蠟塊備用。依次切片、烤片、脫蠟、水化后進行HE(hematoxylin and eosin)染色;鏡下觀察大鼠創面組織的炎癥細胞浸潤、成纖維細胞形態數量及毛細血管分布并行血管計數。

1.3.6 創面組織miR-126a-3p表達水平檢測取第18天的模型組及MEBO組凍存標本置于經滅菌及冷卻的研缽內,邊研磨邊加液氮,研成粉末狀為止,然后轉移至液氮冷卻的EP管中暫存,按照 Trizol法提取總RNA,并取1 μL滴加到紫外分光光度計樣品孔測定其濃度及純度,將濃度大于500 ng/μL,A260/280比值在1.9～2.0內且A260/230比值大于2.0 的總RNA作為逆轉錄模板,按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0(廣州復能基因有限公司,QP115)說明書逆轉錄合成cDNA,然后以cDNA為模板進行qPCR。最終通過2-ΔΔCt法計算miR-126a-3p相對于U6表達量。

2 結 果

2.1 動物一般情況及創面肉眼觀察結果成模后,對照組大鼠精神狀態尚佳,進食飲水、大小便及活動均無異常;模型組及MEBO組大鼠全身狀態均欠佳,兩組大鼠均萎靡不振,嗜睡,多飲,多食,多尿,活動少,消瘦,毛發干枯凌亂無光澤。治療后第 1 天,各組大鼠創面感染癥狀均不嚴重,但均晦暗,淤血,有少許出血、滲液及水腫,無新鮮肉芽腫生長。第 11 天,對照組大鼠創面紅潤潔凈,大片狀鮮紅肉芽組織生成;模型組大鼠創面仍嚴重血肉模糊,污穢潮濕,肉芽組織幾乎不可見。MEBO組大鼠創面較模型組清潔干燥,輕度水腫,少許粉紅色肉芽顆粒形成。第 18 天,對照組大鼠創面已經愈合,且有毛發生長,毛發下可見條狀瘢痕形成;模型組大鼠創面見少許粉紅色肉芽顆粒形成。MEBO組大鼠創面見成片鮮紅色新生肉芽組織。見圖1。

2.2 不同時間點3組大鼠創面愈合率對比治療后第11天及第18天,各組創面愈合率從大到小排列均是對照組、MEBO組、模型組,多重比較差異均有統計學意義(P均<0.001)。并且,治療后第18天各組大鼠創面愈合率均高于第 11 天,對比差異有統計學意義(P均<0.001)。見表1。

2.3 病理形態學結果及新生毛細血管數量治療后第 1 天,光鏡下可見各組創面均出現鱗狀上皮帶狀壞死,大量炎癥細胞浸潤,主要是中性粒細胞浸潤,血管結構不完整,出血嚴重。治療后第 11 天,鏡下見對照組創面壞死組織被溶解吸收,炎癥細胞消退,上皮細胞增生,大量新生毛細血管形成,成纖維細胞增生,形態不規則且排列不整齊;模型組創面仍有較多壞死組織,炎細胞浸潤及出血均未明顯減輕;MEBO 組創面炎癥浸潤較模型組輕,散在新生毛細血管及成纖維細胞生長。治療后第18天,對照組創面再生出上皮組織,毛細血管管腔閉鎖,大量膠原纖維蛋白整齊排列于創面底部。模型組創面炎癥浸潤較前減輕,散在新生毛細血管及成纖維細胞生長;MEBO 組創面壞死組織基本被吸收,炎癥細胞消退,上皮細胞增生,較多新生毛細血管形成,形態不規則成纖維細胞增生(圖2)。治療后第18天模型組和MEBO組毛細血管數量相對于治療后第1天均明顯增加(P<0.001),但MEBO組毛細血管數量增加比模型組更明顯(P<0.001)。見表2。

2.4 創面組織miR-126a-3p表達水平治療后第 18 天,模型組和MEBO 組大鼠創面均有相當數量新生毛細血管生成,取第18天模型組及MEBO組凍存大鼠創面組織標本行qPCR實驗,檢測創面組織中miR-126a-3p的相對表達量。結果表明,與模型組相比,MEBO組創面組織中miR-126a-3p表達量顯著增加(P<0.001)。見圖3。

圖1 不同時間點3組大鼠創面愈合情況對比圖

表1 不同時間點3組大鼠創面愈合率對比

圖2 不同時間點3組大鼠創面組織HE染色圖(Bar=50 μm)

表2 不同時間點模型組和MEBO組大鼠毛細血管數量對比

注：***表示P<0.001

3 討 論

血管新生在創面的及時有效修復中扮演著十分關鍵的角色,新生的血管網形成,可給創面運送豐富的氧氣和營養物質,促進創面修復[12]。目前研究發現,miR-126a-3p參與調節造血干細胞的血管再生和動員,是內皮細胞的功能和血管穩態的特異性生物標志物[4-6]。MEBO為 MEBT/MEBO的主要治療藥物,其通過調控創面炎癥及免疫因子分泌,細胞增殖,新生血管形成及抑制瘢痕增生從而促進創面的無瘢痕修復,并在糖尿病足等多種慢性潰瘍的臨床治療中取得一定療效[13-14]。本研究試圖通過肉眼觀察大鼠創面大體病變,HE染色鏡下了解創面組織病理形態及對新生毛細血管計數,qPCR檢測組織miR-126a-3p表達量,進一步探討MEBT/MEBO 促進糖尿病慢性創面血管新生的分子機制。

miRNA(microRNA,微小RNA)是一種內源性長度為22～25 nt的小RNA分子[15],它能夠通過RISC復合體及其他RNA結合蛋白來調節mRNA的功能[16]。miRNA最常見的結合位點是靶向mRNA的3’-UTR。miRNA的表達失衡將會加快或者延緩血管新生進而影響糖尿病慢性潰瘍愈合[17]。例如,在糖尿病小鼠創面模型中,分別抑制血管內皮生長因子和血管內皮生長因子-受體2 mRNA的miR15b 和miR200b均異常上調,抑制血管生成并延緩了糖尿病創面愈合。相反,抗miR15b和抗miR200b治療改善了創面血管組織生長狀況,加快了修復過程[18]。miR-126a-3p被歸類為血管相關miRNA,能夠特異性靶向萌芽相關蛋白1(sprouty-related protein1,SPRED-1)及3-磷酸激酶調節蛋白2(phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 2,PIK3R2)[19]。研究發現,miR-126a-3p 缺乏可導致血管破裂出血,提示miR-126a-3p在維持血管內皮功能穩定、血管壁完整、血管新生及創面愈合中發揮重要作用,被認為是一種高度特異性促血管新生標志物[20];miR-126a-3p 還能調控 PIK3R2/PI3K/AKT 通路,促進人臍靜脈內皮細胞的生長及血管形成[21]。王琳[22]研究揭示,MEBT/MEBO可通過上調糖尿病足潰瘍患者血清外泌體中miR-126a-3p的表達量,促進創面新生血管形成,改善糖尿病足潰瘍創面的愈合質量。由此可見,miR-126a-3p 可能是個非常有潛力的糖尿病慢性創面治療靶點。

在本研究中,比較治療后第11和第18天的創面愈合率,發現對照組大鼠愈合速度明顯快于模型組和MEBO組,而MEBO組大鼠愈合速度又明顯快于模型組。此外,HE染色結果顯示,對照組大鼠創面愈合質量明顯優于MEBO組和模型組,而MEBO組大鼠愈合質量又明顯優于模型組。治療后第11天,對照組大鼠創面炎癥細胞大幅消退,大量新生毛細血管形成,成纖維細胞及膠原纖維蛋白也開始增加,并在第18天完全再生出皮膚組織,而MEBO 組大鼠創面炎癥細胞浸潤仍然嚴重,且只有少量毛細血管萌芽及成纖維細胞生長,而模型組的則更少。治療18天后MEBO組新增的毛細血管數量明顯多于模型組。治療后第18天,MEBO組創面組織中miR-126a-3p表達量也顯著多于模型組。可見,與正常大鼠相比,糖尿病大鼠創面更加難以愈合,而MEBO可以加速糖尿病大鼠創面愈合速度并改善創面愈合質量。這可能與糖尿病大鼠創面miR-126a-3p表達不足,而MEBO可以刺激miR-126a-3p表達增加進而促進血管新生有關。

綜上所述,MEBT/MEBO 可能通過提高創面組織中miR-126a-3p表達水平誘導血管新生,從而促進糖尿病慢性創面愈合。