壯醫針刺對神經病理性疼痛大鼠的鎮痛作用及其機制研究

廖文彥,廖煉煉▲,莫巧明,艾文杰,鄒文靜,梁英業,蘭蕾,秦祖杰,蒙曉明,張錦超,梁欣,唐林濤,田永強

(1.廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院,廣西南寧 530201;2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西南寧 530023;3.廣西中醫藥大學研究生學院,廣西南寧 530001)

疼痛的發生十分廣泛,被稱為第五大生命體征,是一種在人體受到內外因素損害時極易引發的不適感。國際疼痛研究協會(IASP)對神經病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)的最新定義為：由軀體感覺神經系統的損傷和疾病直接造成的疼痛[1]。NPP是一種常見的慢性疼痛類型[2],可由多種因素誘導發生,在中國[3]、美國[4]、歐洲[5]均有較高的發病率,不僅給患者軀體和心理兩方面造成痛苦,產生了昂貴的醫療費用,還給患者造成工作效率低下等消極影響,帶來了相當的經濟損失[6]。現代醫學常用的藥物療法僅能對NPP患者的部分癥狀具有一些緩解作用,且長期使用此類藥物可帶來不同程度的不良反應[7]。尋求治療NPP的有效方法,解除患者身心痛苦,減輕社會醫療成本和經濟負擔的需求極為迫切,也是當今醫學界研究的熱點。傳統醫學療法在疼痛的治療上有其獨特的優勢,特別是外治療法受到了眾多學者的關注和研究[8-10],其中壯醫針刺療法對于疼痛治療的有效性和安全性在臨床上得到了廣泛認可[11]。但對于壯醫針刺療法治療疼痛的相關作用機制研究目前仍屬空白。IKKβ是神經病理性疼痛病理生理機制中重要的關鍵因子[12],該因子與NPP的發生發展關系密切,其表達升高可引起下游炎癥因子在體內含量增加,從而引起炎癥反應刺激組織神經末梢造成疼痛。有研究發現miR-429對IKKβ的表達具有下調作用[13]。本研究從上述機制切入,以動物實驗方法探索驗證壯醫針刺療法治療疼痛的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗選取50只雄性成年SD大鼠(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供),體重均為250～300 g,生產許可證編號：SCXK(湘)2019-0004,使用許可證編號：SYXK(桂)2019-0001。動物進行7天適應性喂養后開始實驗。實驗全過程嚴格按照廣西中醫藥大學相關規定及科學倫理規范進行,廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會對實驗進行審批及監管。

1.2 主要試劑RIPA細胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M,Elabscience);內參一抗：Mouse Anti-β-Actin(HC201,TransGen Biotech,1/2000);二抗：HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301,Servicebio,1/2000);目的一抗：Rabbit Anti IKKβ (AF6009,Affinity,1/1000)。Trizon Reagent(CW0580S,CWBIO);超純RNA提取試劑盒(CW0581M,CWBIO);miRNA提取試劑盒(CW0627S,CWBIO);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02,Vazyme);miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-02,Vazyme);miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(MQ101-02,Vazyme);50×TAE緩沖液(T1060,Solarbio);6×DNA Loading Buffer(GH101-01,TRANS);50 bp DNA Ladder(MD108,TIANGEN);Gsafe Red plus核酸染料(GK20002,GLPBIO);瓊脂糖粉(75510-019,Invitrogen);ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特,96T,E-EL-R0012)。

1.3 實驗儀器全自動樣品快速研磨儀(Tiss-12,上海凈信實業發展有限公司);高速臺式冷凍離心機(H1750R,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);微型離心機(D1008E,SCJLOGEX);旋渦混合器(XH-C,常州越新儀器制造有限公司);全自動酶標儀(SuPerMax 3100,上海閃普);紫外分光光度儀(NP80,NanoPhotometer);電泳儀(DYY-8C,北京六一生物科技有限公司);普通PCR擴增儀(TC-EA,杭州博日科技有限公司);熒光PCR儀(CFX ConnectTM實時,伯樂生命醫學產品〔上海〕有限公司);超高靈敏度化學發光成像系統儀(Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫學產品〔上海〕有限公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 動物分組將50只SD大鼠隨機分為5組：正常組、假手術組、模型組、非經非穴組、壯醫針刺組,每組10只。

1.4.2 神經病理性疼痛模型大鼠制備按照相關文獻的方法[14],對大鼠L5脊神經進行手術結扎造模(SNL模型)。具體操作為：大鼠常規備皮消毒,以10%水合氯醛溶液按照4 mL/kg的給藥量腹腔注射麻醉。選取大鼠雙側髂后上棘水平連線與脊柱相交處左側部位,沿與脊柱平行方向縱行切開一約2 cm切口,將皮膚、筋膜、肌肉等逐層分離,并將切口撐開,使L5椎體橫突充分暴露,以咬骨鉗分離椎體與橫突之間的骨質,使L5脊神經充分暴露,將該神經以5-0規格粗細手術縫線做雙層結扎,以避免縫線脫落。完成結扎后縫合傷口。操作中應避免牽拉脊神經。模型組、非經非穴組、壯醫針刺組以上述手術造模,假手術組則僅暴露脊神經幾分鐘,不結扎,其他步驟同上。完成手術操作后,觀察大鼠是否出現術側后肢外翻,趾間距變窄、跛行、自發性抬足、不敢著地等情況,并檢測大鼠機械性刺激縮足閾值(PWMT)是否降低,以判斷SNL模型是否造模成功。

1.4.3 行為學觀察PWMT觀測[8]：測試之前先將大鼠放入鐵籠20 min適應。使用不同粗細規格的von-Frey纖維絲接觸刺激大鼠左后足中央。纖維絲粗細代表不同刺激強度(g)。操作時刺激強度由小到大,每種強度下重復5次刺激,每次刺激之間間隔3 s。大鼠在同一刺激強度下出現縮足反應≥3次則記錄為陽性,此強度為該大鼠的PWMT。本實驗重復操作3次,取3次實驗結果的平均值為大鼠最終PWMT。

1.4.4 干預方法造模完成后,正常組、假手術組和模型組不進行干預,僅觀察。壯醫針刺組：于造模完成后第1天開始,采用0.16 mm×13 mm針灸針進行針刺干預,針刺穴位包括手背一環10穴、內上樁、內中樁、內下樁、足背一環7穴。針刺深度3 mm,斜刺進針,留針30 min。穴位具體定位為：手背一環10穴定位,取大鼠前肢第五掌骨橈側距掌指關節3 mm處。內上樁、內中樁、內下樁、足背一環7穴定位,在大鼠足背橫紋中點至第二、第三足趾跖蹼緣上方紋頭之間分4等份,以足背中間點為中心,以1等份為半徑沿足背形狀作一圓環。在足背圓環上按時鐘的1～12時刻分成12等份,每時刻處為1個穴位,共12個穴位。連續干預14天。非經非穴組：于造模完成后第1天開始,每天針刺距離相應穴位3 mm處假穴位點,留針30 min。連續干預14天。

1.4.5 動物組織取材干預結束并完成行為學觀測后,在實驗進行的第14天,以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,取靜脈血并無痛處死,取出大鼠L4～6脊髓背角組織,迅速放入液氮罐,待冷卻后保存于-80 ℃冰箱。

1.4.6 免疫印跡檢測采用免疫印跡法(Western Blot)測定大鼠L4～6節段脊髓背角組織中蛋白含量水平。將大鼠擊碎組織放入試管中,加入細胞裂解液,研磨勻漿后放入離心機離心,提取組織總蛋白,測定濃度。將標本放入電泳儀電泳,隨后進行轉膜,凝膠成像分析,測定出蛋白條帶及內參蛋白條帶灰度值,計算出蛋白的表達水平。

1.4.7 ELISA檢測將大鼠靜脈血離心提取血清,放入酶標儀按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測出血清表達水平。

1.4.8 PCR檢測將大鼠L4～6節段脊髓背角組織裂解勻漿后運用熒光免疫PCR技術檢測其miR-429表達水平。按照試劑說明書操作步驟提取RNA,使用紫外分光光度計測定樣品濃度、純度。電泳后進行逆轉錄反應,將PCR管插入普通PCR擴增儀中,50 ℃條件下保持15 min,然后轉到85 ℃條件下保持5 s。采用(2-ΔΔct)法計算miR-429相對表達量,引物序列如表1。

表1 PCR檢測引物序列

2 結 果

2.1 PWMT檢測結果術前(第0天)各組大鼠之間的PWMT檢測結果比較差異無統計學意義(P>0.05);術后第1天模型組、非經非穴組、壯醫針刺組PWMT檢測結果較正常組、假手術組降低(P<0.01),模型組、非經非穴組、壯醫針刺組之間的PWMT檢測結果比較差異無統計學意義(P>0.05);術后第14天壯醫針刺組的PWMT檢測結果高于模型組和非經非穴組(P<0.01)。見表2、圖1。

2.2 各組大鼠miR-429表達的變化造模后第14天,正常組大鼠脊髓背角組織中miR-429表達處于高水平,高于模型組、非經非穴組、壯醫針刺組大鼠脊髓背角組織中miR-429表達水平(P<0.01),與模型組、非經非穴組相比,壯醫針刺組干預miR-429表達水平上調,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組大鼠IKKβ表達的變化造模后第14天,正常組大鼠IKKβ蛋白表達處于低水平,與正常組相比,模型組脊髓背角組織IKKβ蛋白表達水平升高(P<0.01),與模型組、非經非穴組相比,壯醫針刺組可下調大鼠脊髓背角組織IKKβ蛋白表達水平(P<0.01)。見圖3。

2.4 各組大鼠血清IL-1β含量的變化造模后第14天,正常組大鼠血清IL-1β含量處于低水平,與正常組、假手術組相比較,模型組血清IL-1β含量升高(P<0.01),與模型組、非經非穴組相比較,壯醫針刺組可下調大鼠血清IL-1β含量(P<0.05)。見圖4。

表2 各組大鼠PWMT比較

圖1 各組大鼠術前(第0天)、術后第1天、術后第14天PWMT比較

注：與正常組及假手術組比較,*P<0.01,與壯醫針刺組比較,#P<0.05

注：與正常組、假手術組比較,*P<0.01;與模型組、非經非穴組比較,#P<0.01

注：與正常組及假手術組比較,*P<0.01;與模型組及非經非穴組比較,#P<0.05

3 討 論

壯醫學雖無神經病理性疼痛之稱謂,但壯醫學理論對人體多種疼痛病癥均有論述[15]。通過對神經病理性疼痛的病理生理機制進行分析,發現壯醫學“三道兩路”理論及“筋結”致痛學說可與之相契合[16]。在壯醫學理論中,“三道兩路”是指“水道”“谷道”“氣道”三道和“火路”“龍路”兩路。在人體生理狀態下,三道分別主司水液代謝、食物運化、氣機循環職責,而在兩路之中,龍路是指人體血液循環的系統,火路則可與現代醫學中人體的神經系統相對應[17-18]。壯醫學中有“因結致痛”的說法,即三道兩路不通,氣血瘀堵結聚從而引起疼痛,涵蓋了對疼痛的基本病機和治療原則兩個方面的認識,概括了在相關病理性因素的作用下,如機械性壓迫、勞損而造成的肌肉痙攣、損傷性炎癥等,導致局部組織受力不平衡,產生病理性損傷,在壯醫理論中認為這是氣血堵塞于經筋,凝結阻塞而造成疼痛[19-20]。氣與血在人體密不可分,兩者相互配合發揮生理功能。在壯醫理論中,龍路是血液流動循環的通道,氣推動血在龍路中運行,火路是將人體接收內外刺激傳入大腦(壯語稱為“巧塢”)并將相關反應信號傳出的途徑,作用與現代醫學中的神經系統相類似。故基于壯醫學理論對神經病理性疼痛的認識大致可概括為：局部組織在各種病理因素的作用下,氣血結聚不通,造成龍路的血液循環異常,龍路的暢通受到影響或者相關病理性因子在龍路中積聚,同時因為龍路血液循環的異常或相關病理性因子的刺激,對火路產生作用,產生相關疼痛信號并通過火路傳入大腦(“巧塢”),造成神經病理性疼痛發病。

本實驗選取的壯醫針刺穴位為手背一環10穴、內上樁、內中樁、內下樁、足背一環7穴,體現了壯醫針刺療法所遵循的“天圓地方”的配穴理論指導原則[21]。該理論以取象比類的思維,將中國古代哲學思想中的“天圓地方”運用到壯醫臨床實踐。在該理論看來,“天圓”意為如圓環一般機動、靈動,在配穴時著重使用環穴。“地方”則代表穩固、平衡,即通過動態的調節以達到人體穩固健康的平衡狀態。手背一環10穴位于手部,為天部環穴之一,由于手部運動頻率高,且能完成人體最精巧復雜的動作,神經末梢分布豐富且敏感,大腦中與手部對應的皮層面積最大,故壯醫認為手部與“巧塢”(大腦)的關聯緊密,通過刺激手部穴位,可將針刺的刺激迅速傳至大腦,調動人體形成良性反饋循環,改善疼痛狀況。內上樁、內中樁、內下樁又合稱“地內三樁”,為地部穴,與天部上下對應,共同調整人體整體氣血狀況。足背一環7穴是足背環穴之一,該穴對于針刺刺激亦較為敏感,常用于治療腰腿痛,治療部位更偏于人體下部。上述諸穴合用可共奏通利人體氣血,疏通三道兩路之瘀阻以緩解疼痛之功。

白細胞介素-1β(IL-1β)廣泛參與機體內多種生理病理過程,是最重要的促炎因子之一,在炎癥發生的過程中,可誘導多種細胞因子的釋放而產生或加重炎癥刺激。且IL-1β還可使多種疼痛介質釋放增加,導致疼痛的程度加劇[22]。

IKKβ是NF-κB 經典信號通路的重要因子,其活性環通過的絲氨酸磷酸化構成NF-κB 信號通路啟動的必要因素。NF-κB通路廣泛參與多種免疫反應、炎癥表達、細胞凋亡等生物進程,是調控炎癥反應的重要通路[23]。

miRNA(微小RNA,microRNA)具有單鏈結構,不具有編碼蛋白質的功能,核苷酸長度在18～25個之間,對基因調控具有重要作用。miRNA在生物體中作用廣泛,通過其介導的控制機制,可調控多種生理病理機制[24]。有研究表明[13],miR-429對IKKβ具有靶向調控作用,可下調IKKβ的表達,從而抑制IKKβ對疾病的影響。

在本研究中,術后第1天,模型組大鼠PWMT較正常組降低,術后第14天,壯醫針刺組大鼠PWMT較模型組升高,表明實驗造模成功,壯醫針刺對SNL模型大鼠的疼痛具有改善作用。造模后第14天,模型組大鼠血清IL-1β含量較正常組升高,壯醫針刺組血清IL-1β較模型組降低,表明造模導致大鼠神經損傷,炎癥因子釋放增加,激活炎癥反應導致疼痛,經壯醫針刺干預后炎癥因子含量減少,減輕了神經所受到的炎癥刺激,使疼痛得以緩解。術后第14天,模型組大鼠脊髓背角組織IKKβ表達較正常組增多,壯醫針刺組大鼠脊髓背角IKKβ蛋白表達較模型組減少,表明SNL模型大鼠IKKβ蛋白表達升高,炎癥信號通路活躍,誘發炎癥反應造成疼痛,而壯醫針刺干預可下調IKKβ蛋白表達水平,壯醫針刺可能通過抑制炎癥信號通路的活躍程度達到緩解疼痛的效果。術后第14天,模型組大鼠脊髓背角組織miR-429表達較正常組減少,壯醫針刺組大鼠脊髓背角組織miR-429蛋白表達較模型組增多,表明NPP發生時,miR-429表達減少,從而削弱了其對IKKβ/NF-κB炎癥通路的抑制作用,而壯醫針刺干預可上調miR-429表達水平,壯醫針刺可能通過增加miR-429的表達從而下調IKKβ以達到緩解疼痛的效果。

綜上我們推斷,壯醫針刺或可以通過上調miR-429表達而抑制IKKβ/NF-κB炎癥通路的活性,減少炎癥因子IL-1β的釋放,從而獲得緩解NPP所造成的疼痛的效果。