膿毒癥相關急性腎損傷的生物學標志物研究進展

李 茹 杜賢榮 楊曉宇 劉文操

膿毒癥是機體對感染反應失調引起的危及生命的器官功能障礙[1]。急性腎損傷是膿毒癥的嚴重并發癥,隨著其發生率及病死率的不斷增加,每年影響世界數百萬人,導致30%～60%的患者死亡[2]。同時使腎臟替代治療使用率增加,機械通氣、重癥監護病房住院時間延長,增加醫療費用并且消耗醫療資源。因此,尋找膿毒癥相關急性腎損傷(sepsis-associated acute kidney injury,S-AKI)早期敏感的生物學標志物至關重要;由于S-AKI機制尚不明確,常規的血肌酐和尿量在診斷和評估腎功能時存在局限性,使得S-AKI患者病死率居高不下。近年來,隨著分子生物學技術及基因工程的蓬勃發展,一些生物學標志物在早期診斷腎損傷方面顯示出較高的特異性和敏感度,在S-AKI的診療方面有很大潛力。

一、S-AKI診斷現狀

根據2012年改善全球腎臟病預后組織(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)對AKI診斷標準[3]:①48h內腎功能突然下降,血肌酐絕對值升高≥26.5μmol/L(0.3mg/dl);②血肌酐增加≥基礎值的1.5倍;③尿量<0.5ml/(kg·h),持續時間>6h。當符合標準兩項及以上時,急性腎損傷診斷成立。目前仍然是依據血肌酐和尿量的變化來評估腎功能,然而只有腎小球濾過率降低至正常值的約30%時,血肌酐才會明顯升高,因此,以血肌酐來間接評估腎功能的方法存在滯后性[4];再者血肌酐水平受許多因素影響,包括飲食、藥物治療、肌肉質量、性別和種族等差異,這可能導致嚴重低估腎功能障礙的程度,延誤治療時機。尿量同樣作為急性腎損傷的標志,缺乏特異性和敏感度,可能是因為少尿是機體對緊張性刺激的一種適當的生理反應,且尿量可能在嚴重的腎損傷時才出現減少[5]。因此,以肌酐和尿量為標準的AKI診斷缺乏理想的敏感度和特異性。

二、新型生物學標志物

由于近年來對S-AKI病理生理、分子機制的不斷探索和分子生物學技術的快速發展,發現了多種S-AKI早期診斷和監測的敏感又特異的新型生物學標志物,這些生物學標志物不但可以在血肌酐升高之前對S-AKI的診斷提供線索,而且還能幫助了解腎損傷的部位和程度,以及預測AKI治療的效果及預后,為急性腎損傷的治療帶來了希望。

1.胱抑素C(cystatin C, CysC):CysC由有核細胞產生,經腎小球過濾,然后主要在近端腎小管細胞中被重吸收和分解代謝。其在預測老年患者的心血管事件和病死率方面優于血肌酐。因此,與血肌酐比較,CysC是更可靠的腎功能標志物;然而它容易受到年齡、大劑量皮質類固醇、甲狀腺功能狀況、炎癥和惡性腫瘤的影響,需要大量臨床數據深入研究[6]。由于血肌酐濃度的變化有一定的局限性,尤其是在危重癥患者臨床病程的后期,尿液中CysC濃度似乎不受S-AKI患者肌酐水平的影響,因此,CysC在S-AKI早期診斷和評估危重癥患者病情進展方面具有巨大潛力。

2.腎損傷因子-1:腎損傷因子-1(kidney injury molecule-1, KIM-1)是一種跨膜糖蛋白,包含細胞外免疫球蛋白和黏蛋白結構域,在正常健康人的腎臟中低表達。然而其在缺血再灌注損傷后上調,特別是在腎損傷48h后近端腎小管上皮細胞中明顯升高,這提示KIM-1似乎是S-AKI的高度敏感的標志物[7]。研究證實,當腎小管進行性損傷時血清KIM-1持續升高,其可能增加慢性腎臟疾病發展的風險,而尿液KIM-1也顯示出與腎損傷具有一定的相關性[8]。因此,KIM-1是急性腎小管損傷的早期敏感指標。

3.中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白:中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipids transport proteins, NGAL)是脂質載體蛋白超家族的一種糖蛋白,主要在中性粒細胞表面表達,同時在其他細胞類型(如腎細胞和肝細胞)中也少量存在,是近年來研究較為熱門的方向。在正常情況下,NGAL通過腎小球過濾,并在近端小管被重吸收。如果腎小管系統在缺血性或腎毒性腎損傷期間受到影響,NGAL的表達會迅速上調,因此,在腎損傷發作后3h,即可在尿液中檢測到NGAL。研究表明,與促炎性細胞因子比較,血漿NGAL水平似乎與中性粒細胞計數有更強的相關性,所以在全身炎性反應患者中,由于中性粒細胞減少,仍可能出現較低的血漿NGAL水平。如果腎小管系統受到影響,伴有中性粒細胞減少癥的AKI患者的尿NGAL水平也可能顯著升高,因此,在炎癥活動或腎損傷時NGAL水平皆會出現波動[9]。

近年來,NGAL與鐵調素(鐵穩態的主要調節因子)一起被發現在S-AKI預后不良的患者中明顯升高,提示NGAL結合鐵載體在抗菌作用方面具有潛在的研究價值。有研究表明,尿NGAL水平升高反映了近端小管功能障礙或損傷導致濾過NGAL重吸收減少,而在S-AKI期間,其表達也在腎小管系統中上調,并發現其敏感度優于CysC和KIM-1等生物學標志物,是S-AKI的獨立危險因素,對S-AKI早期診斷有重要的價值[10]。

4.可溶性髓樣細胞觸發受體-1:髓樣細胞1所表達的觸發受體(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)是一種先天性免疫性受體,與無菌性和非無菌性炎癥疾病中的炎癥密切相關。該受體的2種亞型分別為膜型(mTREM-1)和可溶性型(sTREM-1),已經在幾種細菌性疾病和膿毒癥的免疫性疾病機制中進行了大量研究。由于炎癥是幾種細菌感染的結果,因此,抑制該受體被認為是治療膿毒癥的可靠方法[11]。在正常人尿液中,sTREM-1水平極低,難以檢測出來,而在膿毒癥患者的尿液中可以被檢測到,所以尿液中sTREM-1水平成為目前AKI早期診斷的熱門研究方向。有研究者對膿毒癥患者尿液中的sTREM-1水平進行動態監測及分析,提示尿液sTREM-1水平是膿毒癥患者發生AKI的獨立危險因素[12]。

5.肝型脂肪酸結合蛋白:肝型脂肪酸結合蛋白(liver-type fatty acid binding protein, L-FABP)是一種相對分子質量為14kDa的胞質蛋白,主要在肝臟中表達,在腎臟、腸、胃和肺中也有少量表達[13]。有研究顯示,尿液L-FABP水平在一些急性腎臟疾病,如缺血再灌注損傷/低灌注、膿毒癥和腎毒性藥物誘導的AKI中升高,提示尿液L-FABP可用于早期診斷監測S-AKI[14]。更有實驗表明,尿液L-FABP與AKI中蛋白質重吸收受損密切相關,因此,尿液L-FABP被認為是腎小管損傷的特異性標志物[15]。導致L-FABP尿排泄增加的確切病理生理途徑尚不明確,需要進一步探索。

6.組織金屬蛋白酶抑制劑-2和胰島素樣生長因子結合蛋白-7:腎小管細胞在AKI發生前會出現應激反應進行自我保護,即分泌一種阻滯蛋白使細胞周期停止,然而在AKI期間持續的細胞周期停滯可能導致適應性修復不良,最終導致纖維化。研究證實,胰島素樣生長因子結合蛋白-7(insulin-likegrowth factor binding protein-7, IGFBP-7)和組織金屬蛋白酶抑制劑-2(insulin-likegrowth factor binding protein-2, IGFBP-2)通過阻斷周期蛋白依賴性蛋白激酶復合物的作用,參與了G1細胞周期阻滯的細胞應激早期階段,已被確定為早期檢測腎損傷高度敏感和特異的生物學標志物[16]。IGFBP-7聯合TIMP-2在心臟手術后人群中的臨床應用也得到了進一步的研究[17]。有研究發現,TIMP-2聯合IGFBP-7對中、重度AKI的敏感度為81.2%,該組合對AKI的早期診斷優于NGAL、KIM-1、L-FABP等已知的生物學標志物[18]。因此,TIMP-2聯合IGFBP-7在膿毒癥相關AKI的早期診斷中具有至關重要的作用。

7.可溶性δ樣蛋白1(soluble delta-like 1,sDLL1):與血管內皮細胞功能障礙相關的血管滲漏是膿毒癥的標志,而血管內皮完整性降低的原因是病原體成分、炎癥相關宿主因子、血管內皮細胞和活化循環免疫細胞相互作用的復雜反應[19]。內皮功能障礙是S-AKI的重要機制,內皮細胞受到炎癥刺激時產生一氧化碳,導致血管擴張、自我調節失調和內皮功能障礙,內皮細胞之間的分泌蛋白和黏附因子相互作用以及內皮細胞和白細胞之間允許白細胞通過的復雜相互作用介導,從而導致腎小管內皮細胞功能障礙,最后形成AKI[20]。因此,S-AKI的發展與血管內皮完整性密切相關。有研究發現,調節血管內皮完整性的一個信號通路是Notch級聯,其通過Notch配體與其相應的Notch受體的結合而被激活[21]。有研究顯示,Notch配體的可溶形式sDLL1在膿毒癥患者的血液中含量很高,這為S-AKI患者早期診斷提供了新的方向。

為了研究感染相關患者sDLL1的影響,Moll等[22]在細胞遷移和侵襲實驗中用血液培養的人臍靜脈細胞進行研究,由于sDLL1刺激可誘導內皮細胞激活進而使內皮細胞緊密結構和屏障功能喪失,因此,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的人臍靜脈細胞激活和內皮細胞通透性的增加,其可以通過阻斷與sDLL1受體結合從而使Notch信號轉導顯著降低,證實了LPS介導的內皮功能障礙中的級聯反應,結果表明,在細菌感染和LPS識別過程中,sDLL1激活的Notch信號與血管通透性相關。為進一步證實sDLL1在膿毒癥患者中的變化,有研究者進行了一項前瞻性實驗,結果表明,在膿毒癥患者中,血液中可溶性Notch配體sDLL1的升高特別明顯[23]。另有研究確定了sDLL1對AKI檢測的預測價值,使其成為重癥監護AKI患者的潛在生物學標志物[24]。目前AKI患者尿液中sDLL1的相關研究較少,無確切證據表明尿液中sDLL1與AKI的相關性,還需開展進一步研究予以證實。

8.外泌體:健康人和患有不同疾病的人釋放到循環/體液中的外泌體成分(蛋白和RNA)是不同的,它是由原核細胞和真核細胞釋放的納米大小的包被有雙層結構的小囊泡,富含多種生物活性物質,如蛋白質、核苷酸和脂質[25]。外泌體廣泛存在于各種體液和細胞培養上清液中,其通過這些活性成分向靶細胞穿梭從而介導機體的生理和病理過程[26]。有研究表明,多種細胞來源的外泌體在急性和慢性腎臟疾病中可以發揮有益的作用,特別是來源于間充質干細胞的外泌體在臨床試驗中對腎病的預防和治療有顯著療效。

研究表明,外泌體中的微小RNA(microRNA,miRNA)可以反映損傷和纖維化狀態,如miR-9a、miR-16、miR-200a和miR-141的釋放[27]。尿液是外泌體研究中最常用的生物體液,尿液中外泌體的研究成為近幾年的熱門話題;還有其他如Na+/H+交換器異構體3也有望成為S-AKI相關的外泌體生物學標志物[28]。

9.非編碼RNA:超過80%的人類基因組被轉錄成沒有蛋白質編碼能力的RNA,這種功能基因組轉錄物被稱為非編碼RNA。非編碼RNA主要包括miRNA、長非編碼RNA、環狀RNA、小核仁RNA、P元件誘導的睪丸肥大相關RNA和轉移RNA。不同的非編碼RNA通過特定的機制發揮作用,越來越多的證據表明,非編碼RNA在AKI中起重要作用。然而,非編碼RNA調節AKI炎癥相關基因表達的具體機制尚未完全闡明。

外泌體中包含的miRNA對S-AKI的早期診斷具有一定的價值,如外泌體miR-19b-3p(可調節炎性反應);研究發現,LPS誘導的AKI動物模型中腎小管上皮細胞外泌體miR-19b-3p比對照組顯著增加了59.7倍,可作為S-AKI潛在的生物學標志物[29]。Ji等[30]研究表明,miR-320-3p是S-AKI患兒死亡的獨立危險因素;還有研究表明,尿液中miR-452的增加可能是膿毒癥患者早期檢測AKI的有效生物學標志物[31]。

三、膿毒癥相關急性腎損傷研究的局限性及展望

本研究所涉及的新型生物學標志物,包括TIMP-2聯合IGFBP-7、NGAL、KIM-1和CysC等,可以使用常規診斷測定法進行測量,從而在短的周轉時間(少于1h)內提供準確的結果,但仍需進一步研究來證實這些生物學標志物的敏感度和特異性。但外泌體因其種類繁多,如蛋白和核酸測量較為復雜,檢查項目繁多且技術要求高,加之費用高昂,不適用于基層單位早期診斷S-AKI。總之,由于受當前技術要求的限制,研究者致力于開發更快速、有效且實用的方法。

S-AKI的早期診斷和有效治療是降低患者病死率的關鍵。然而目前使用的生物學標志物(膿毒癥:降鈣素原、乳酸清除率、C反應蛋白;AKI:血肌酐、尿量)顯示了關于膿毒癥和AKI的診斷和預后的局限性,因此,尋找新的生物學標志物迫在眉睫。盡管大多數AKI生物學標志物提供了關于腎小管系統損傷有價值的信息,然而監測血清和尿液外泌體如非編碼RNA等可以出現更加精準、敏感的信息,更可靠地用于評估涉及腎小球和腎小管源性腎損傷的整體腎損傷。此外,這些標志物的增加可以指導開始腎臟替代治療的時機,從而有效減輕腎損傷并改善S-AKI的預后,因此可以為S-AKI的早期診斷和治療提供保障。新型生物學標志物CysC、KIM-1、NGAL、sTREM-1、L-FABP、TIMP-2和IGFBP-7、sDLL1、外泌體、非編碼RNA提供了一種用于監測炎癥狀況且非侵入性的檢測指標,由于S-AKI是一種異質性的臨床綜合征,單獨測量單一標志物不足以達到準確診斷和監測的目的。因此,涉及各種血清和尿液生物學標志物的多標志物方法和臨床參數的聯合應該應用于S-AKI的早期診斷。