DCTN2和CREPT在胃癌組織中的表達及其對胃癌患者預后的影響

肖 娜 夏素芹 李 莉

胃癌是全球第五大常見的惡性腫瘤,其發生率及病死率占我國惡性腫瘤的第2位[1]。早期胃癌患者經內鏡及外科治療后,其5年生存率可達91%[2]。由于其早期癥狀不典型,絕大多數患者確診時已處于中晚期,失去了手術治療的機會,其5年生存率不超過25%[3]。因此,早發現、早診斷、早治療是胃癌診療中的關鍵。

動力蛋白激活蛋白(dynactin, DCTN)是一種多亞基復合物,通過激活動力蛋白,參與細胞的有絲分裂、細胞骨架重新組裝及調控物質向微管負端運輸,在各種細胞功能中發揮著許多重要作用[4]。DCTN2目前被認為是DCTN的主要調節者和微管交通的組織者,與惡性黑色素瘤、結腸腺癌等多種疾病的發生有關,因為其龐大而復雜的結構,其作用的機制尚未得到充分研究[5,6]。

腫瘤高表達細胞周期相關蛋白(cell-cycle-related and expression-elevated protein in tumor,CREPT)能夠和轉錄中的關鍵酶--RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)在癌基因細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)上結合,使Cyclin D1基因形成環狀結構,從而促進基因的轉錄,加速細胞周期的進程、增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力,促進腫瘤的發生與發展,為腫瘤的基因診斷和基因靶向治療提供了新思路[7]。目前已發現CREPT與非小細胞肺癌、腎癌、宮頸癌等腫瘤的發生、進展密切相關,而CREPT在胃癌中的表達水平及其與胃癌患者預后的關系尚不明確[8～10]。本研究通過免疫組化法檢測DCTN2和CREPT在胃癌及癌旁組織中的表達水平,分析其與胃癌患者的臨床病理特征及預后的關系,初步探討DCTN2和CREPT在胃癌診斷及預后預測中的價值。

對象與方法

1.研究對象:納入2014年3月～2015年9月在徐州醫科大學附屬醫院初治并接受胃癌切除術的90例胃癌患者,其中男性51例,女性39例,患者中位年齡為61歲,回顧性收集90例胃癌患者的術后腫瘤組織、癌旁組織(取材距腫瘤邊緣≥5.0cm,且病理證實無腫瘤細胞浸潤)和臨床資料,所有患者均經組織病理學證實為胃癌,其中70例胃癌患者術后接受化療,20例患者術后未化療。納入標準:①組織病理學確診為胃癌;②初治患者,術前未接受放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療;③具有完整的腫瘤標志物及影像學評估資料;④隨訪資料完整。排除標準:①無明確病理診斷信息;②合并有高血壓、糖尿病、冠心病等基礎病或其他腫瘤;③隨訪信息不完整或失訪者。隨訪90例胃癌患者的1、3、5年生存率,隨訪截止時間為2022年9月,納入的90例患者均完成隨訪。在長期隨訪中,死亡患者均因胃癌復發轉移所致。本研究獲得徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理學委員會審核批準。

2.免疫組化法檢測及結果判讀:采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)連結法進行免疫組化染色,即:組織切片經烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、內源性過氧化物酶滅活、抗原修復、通透、封閉后,滴加DCTN2單克隆抗體(1∶200,Proteintech,武漢三鷹生物技術有限公司)和CREPT單克隆抗體(1∶200,美國Thermo Fisher公司),將組織切片置于4℃孵育過夜。次日取出組織切片置于37℃復溫45min,滴加生物素標記的二抗(1∶200,徐州微科曼得生物工程有限公司),37℃條件下孵育1h,滴加SP后37℃條件下孵育30min。上述反應中,除血清封閉外,其余各步后均需用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗。隨后滴加DAB液顯色10min,自來水沖洗10min后終止反應,使用蘇木精(上海碧云天生物技術有限公司)復染2min,鹽酸乙醇分化,充分水洗返藍后,梯度乙醇脫水,二甲苯溶液透明,干燥后使用中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察拍照并保存。

病理參數采用陽性腫瘤細胞百分比評分和染色深度評分的乘積進行評估。陽性腫瘤細胞百分比評分是選取鏡下5個視野(×400倍鏡)的陽性細胞平均數計分:0～5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。染色深度評分是多數細胞呈現的染色深淺與背景著色情況對比計分:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。2個參數相乘得出免疫反應性評分(immunereactivity score, IRS),范圍為0～12分,評分<6分記為低表達,≥6分記為高表達。

3.統計學方法:應用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行統計分析,采用Graphpad prism 8進行做圖。計數資料以例數(百分比)[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗;采用Spearman法分析DCTN2與CREPT表達的相關性;采用Kaplan-Meier法分析DCTN2和CREPT的表達水平與胃癌患者預后的關系并繪制生存曲線圖,組間差異比較采用Log-rank檢驗;采用COX比例風險模型進行單因素和多因素分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1. DCTN2和CREPT在胃癌及癌旁組織中的表達水平:免疫組化結果顯示,DCTN2蛋白表達定位于胃癌細胞的細胞質中,CREPT蛋白表達定位于細胞核內。對DCTN2和CREPT的表達水平進行統計分析后得知,胃癌組織中有68例(75.56%)出現DCTN2高表達,而癌旁組織中僅有20例(22.22%)出現DCTN2高表達,癌組織中DCTN2的高表達率明顯高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.001)。胃癌組織和癌旁組織中分別有66例(73.33%)和26例(28.89%)出現CREPT高表達,癌組織中CREPT高表達率亦明顯高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.001),詳見圖1和表1。

表1 DCTN2和CREPT在胃癌和癌旁組織中的表達情況[n(%)]

圖1 免疫組化法檢測DCTN2和CREPT在胃癌組織和癌旁組織中的表達(×400)A.胃癌組織中DCTN2的表達(高表達);B.癌旁組織中DCTN2的表達(低表達);C.胃癌組織中CREPT的表達(高表達);D.癌旁組織中CREPT的表達(低表達)

2.胃癌組織中DCTN2與CREPT的表達相關性:胃癌組織中共有60例(66.67%)出現DCTN2與CREPT共同高表達,12例(13.33%)出現DCTN2與CREPT共同低表達,兩者在胃癌組織中的表達呈正相關(r=0.442,P<0.05)。

3.胃癌組織中DCTN2和CREPT表達與患者臨床病理特征的關系:胃癌組織中DCTN2和CREPT的表達水平與患者的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移密切相關,即分化程度越低、TNM分期越高(Ⅲ～Ⅳ期)、浸潤深度越深(T3～T4)、有淋巴結轉移的胃癌患者更容易出現DCTN2和CREPT高表達,差異均有統計學意義(P<0.05)。此外,患者的性別、年齡、是否出現遠處轉移對DCTN2和CREPT的表達無顯著影響,差異均無統計學意義(P>0.05),詳見表2。

表2 胃癌組織中DCTN2和CREPT表達水平與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

4.胃癌組織中DCTN2和CREPT表達水平對患者預后的影響:DCTN2高表達組胃癌患者的術后1、3、5年累積生存率及總生存率分別為86.76%、69.12%、52.94%和20.59%,均明顯低于DCTN2低表達組胃癌患者的術后1、3、5年累積生存率及總生存率(分別為100.00%、85.71%、68.18%和54.55%),差異均有統計學意義(P均<0.05)。CREPT高表達組胃癌患者的術后1、3、5年累積生存率及總生存率分別為69.70%、46.97%、22.73%和19.70%,均明顯低于CREPT低表達組胃癌患者的術后1、3、5年累積生存率及總生存率(分別為100.00%、83.33%、70.73%和62.50%),差異均有統計學意義(P均<0.05),詳見表3、圖2和圖3。

表3 胃癌組織中DCTN2和CREPT表達水平對患者生存率的影響[n(%)]

圖2 胃癌組織中DCTN2表達水平對患者總生存期的影響

圖3 胃癌組織中CREPT水平對患者總生存期的影響

5.影響胃癌患者預后的單因素和多因素COX回歸分析:單因素COX回歸分析結果顯示,DCTN2表達水平、CREPT表達水平、年齡、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移是影響患者預后的重要因素(P<0.05),詳見表4。將上述結果中差異有統計學意義(P<0.05)的預后因子進一步納入多因素COX比例風險回歸模型,結果顯示,DCTN2表達水平、CREPT表達水平、TNM分期及有無遠處轉移是影響胃癌患者預后的獨立危險因素,即DCTN2高表達、CREPT高表達、TNM高分期(Ⅲ～Ⅳ期)及有遠處轉移的胃癌患者的死亡風險分別是DCTN2低表達、CREPT低表達、TNM低分期(Ⅰ～Ⅱ期)及無遠處轉移的胃癌患者的4.790、4.516、4.647、10.517倍,詳見表5。

表4 影響胃癌患者預后的單因素COX回歸分析

表5 影響胃癌患者預后的多因素COX回歸分析

討 論

胃癌是一種分子和表型高度異質的疾病,在全球惡性腫瘤中居第5位,是第三大常見癌癥死亡原因,幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽及低水果和蔬菜飲食是其主要的危險因素[11]。盡管手術、化療、靶向治療、放療、免疫治療等治療手段不斷進步,其預后仍不理想。因此,早期診斷胃癌及尋找新的治療靶點,是目前研究的重點。

細胞質動力蛋白是一種以腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)為能量將化學能轉化為機械能的蛋白質,為真核細胞中分子貨物向微管負端運輸提供動力[12]。DCTN可與動力蛋白尾部結合,激活其產生生物學活性[13],此過程需要尖端蛋白Arp11、p62、p25和p27等協助,再通過結合不同接頭蛋白,如Bicaudal-D2(BICD2)、HookA組成沿著微管移動輸送貨物的運輸機器[14,15]。DCTN蛋白是由DCTN家族基因(DCTN1～6)編碼的多亞基蛋白質,具有參與激活動力蛋白、細胞有絲分裂、細胞骨架重新組裝和細胞內物質運輸等作用[4]。DCTN2基因位于染色體12q13～q15上,該區域在多種癌癥中穩定擴增。DCTN2在人皮膚黑色素瘤、結腸癌、低級別膠質瘤等多種腫瘤中呈現高表達狀態[5,6,16,17]。

近年來研究表明,DCTN2與動力蛋白依賴性自噬體聚集和自噬成熟有關[18]。除此以外,DCTN2通過調控腫瘤血管的異常生成,促進腫瘤的細胞增殖及侵襲。本研究發現,胃癌組織中DCTN2呈高表達狀態,分化程度越低、TNM分期越高(Ⅲ～Ⅳ期)、浸潤深度越深(T3～T4)、有淋巴結轉移的胃癌患者更容易出現DCTN2高表達,且DCTN2高表達胃癌患者的術后1、3、5年累積生存率及總生存率均顯著低于DCTN2低表達的胃癌患者,此外,DCTN2的表達水平是影響胃癌患者預后的獨立因素,這些提示DCTN2可能與胃癌的發生與進展有關,DCTN2的高表達是胃癌患者預后不佳的影響因素之一。

CREPT是酵母Rtt103的人類同源物,定位于20號染色體,是含有C末端結構域、相互作用結構域的含核前mRNA結構域的調節蛋白,主要參與DNA損傷修復和終止RNA轉錄,細胞周期轉變失控以及細胞周期相關基因和蛋白表達改變促進了腫瘤的發生[19,20]。2012年,我國研究者報道了人類腫瘤相關的一個新基因--CREPT,并提出CREPT通過增強RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)向CyclinD1啟動子區域募集,促進染色質環形成并阻RNAPⅡ讀取基因3′末端終止位點,從而增加CyclinD1的轉錄,加速細胞周期G1/S期轉變,從而促進腫瘤細胞增殖,加速腫瘤生長[7]。同時CREPT調控細胞周期蛋白B1促進細胞周期G2/M期轉變[20]。此外,CREPT還可以誘導CDNK1、CDK6和C-MY等細胞周期相關基因的轉錄,最終加速細胞周期,促進細胞增殖。

近年來,研究表明,CREPT可通過與p300相互作用促進Wnt/β-連環蛋白途徑,從而促進癌癥生長,也可增強STAT3轉錄活性,促進腫瘤細胞增殖、集落形成,從而導致腫瘤的發生[21,22]。CREPT在非小細胞肺癌、結腸癌、腎癌、乳腺癌、子宮內膜癌等多種腫瘤中高表達,且與不良預后密切相關[8～10,23,24]。在本研究中,胃癌組織中CREPT表達水平顯著高于癌旁組織,CREPT表達水平與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移有關,進一步說明CREPT高表達促進腫瘤細胞的增殖及轉移。此外,本研究的預后分析結果顯示,CREPT高表達的胃癌患者術后5年生存率及總生存率顯著低于CREPT低表達者,CREPT表達水平是影響胃癌患者預后的獨立因素。

綜上所述,DCTN2和CREPT有望成為胃癌診斷的新型標志物及治療新靶點,并有助于判斷胃癌患者的預后。但本研究樣本量較小,未能深入研究DCTN2和CREPT在胃癌發病機制中的相互作用,需擴大樣本量以及進一步對兩者之間的相互作用關系及致癌機制進行深入研究。