莪術揮發油酶法提取工藝及抗氧化活性研究

蔣德旗，莫杰梅，蔣麗林，臧青民，徐蘭程，陳曉白

玉林師范學院生物與制藥學院，廣西高校亞熱帶生物資源保護與利用重點實驗室，廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室（玉林 537000）

莪術為姜科植物蓬莪術、廣西莪術或溫郁金的干燥根莖，在我國主產于廣西、云南等地，其功效包括行氣破血、消積止痛等[1]。莪術有效成分主要包括揮發油、姜黃素和多糖類，其中揮發油含量較多，揮發油藥用活性成分為莪術醇、β-欖香烯、莪術酮等萜類化合物[2]，已被制成多種劑型，如莪術油注射液、栓劑、軟膏等，臨床用于抗病毒、抗菌消炎，具有較好療效。此外，莪術還有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集等多種藥理活性[2-3]。目前莪術揮發油提取主要采用水蒸氣蒸餾、微波或超聲輔助提取、索氏提取、超臨界提取等方法[4-5]，這些方法存在提取率低、提取時間過長、需要大型設備等不足。纖維素酶可通過降解纖維素，破壞植物細胞壁，促進胞內活性成分有效溶出，提高提取率，已被用于當歸、茴香揮發油提取[6-7]。研究使用纖維素酶預處理輔助提取莪術揮發油，優化其提取工藝并探究體外抗氧化活性，以期將莪術揮發油進一步開發為食品保鮮劑或保健品添加劑提供更多試驗證據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

莪術購自廣西玉林中藥港，經玉林師范學院陳曉白教授鑒定為姜黃屬植物廣西莪術（Curcuma kwangsiensis）的干燥根莖；纖維素酶（5萬 U/g，北京索萊寶科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；L-抗壞血酸分析標準品（上海麥克林生化科技有限公司）；檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、無水硫酸鈉、石油醚（國產分析純，西隴化工股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

FW135中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器）；5 mL揮發油提取測定器（江蘇三愛思儀器設備）；98-I-B磁力攪拌電熱套（菲斯福儀器）；RV-211A旋轉蒸發儀（上海一恒科學儀器）；SHY-2A水浴恒溫振蕩器（常州國宇儀器）；FA1004B電子分析天平（上海佑科儀器儀表）；PHSJ-6L pH計（上海儀電科學儀器）；TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器）。

2 方法

2.1 水蒸氣蒸餾提取

粉碎廣西莪術，過0.425 mm篩，準確稱取50 g放入1 000 mL圓底燒瓶中，加10倍量蒸餾水室溫浸泡12 h后，經水蒸氣蒸餾4 h。蒸餾液加石油醚作為萃取劑，萃取相加無水硫酸鈉靜置脫水，采用減壓旋蒸法去除石油醚，得到廣西莪術揮發油，精密稱定質量。揮發油得率=揮發油質量/莪術質量×100%。

2.2 纖維素酶輔助提取單因素試驗

準確稱取50 g過0.425 mm篩的莪術粉末，按料液比1∶10 g/mL加入蒸餾水，添加一定量的纖維素酶（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%），調節pH（4.0，4.4，4.8，5.2和5.6），分別在不同溫度下（40，45，50，55和60 ℃）酶解處理一定時間（0.5，1.5，2.5，3.5和4.5 h）。單因素試驗優化某一條件時，其他因素固定值分別為酶添加量1.5%、酶解pH 4.8、酶解溫度50 ℃、酶解時間2.5 h，搖床速度為120 r/min。纖維素酶預處理完畢后，再按照2.1小節方法提取揮發油。

2.3 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，以酶添加量、酶解pH及酶解時間為自變量，揮發油得率為響應值，利用Box- Behnken響應面法對提取工藝進行優化，設計三因素三水平，見表1。數據分析使用Design Expert Version 13.01.0軟件。

表1 響應面試驗設計的因素與水平

2.4 抗氧化活性分析

莪術揮發油體外抗氧化活性檢測及自由基清除率計算均參照黃培池[8]的研究方法進行。樣品溶液檢測前使用無水乙醇配成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL不同質量濃度的系列溶液。DPPH清除能力檢測：2 mL樣品溶液與2 mL 0.1 mmol/mL的DPPH溶液充分混勻，避光靜置30 min后檢測其在517 nm波長處的吸光度。羥自由基清楚能力檢測：1 mL樣品溶液與2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液充分混勻后靜置10 min，再向混合溶液中加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，在50 ℃水浴30 min后檢測其在510 nm波長處的吸光度。以等體積相同濃度抗壞血酸溶液代替樣品溶液作為陽性對照。

3 結果

3.1 單因素試驗

隨著酶添加量的增大，莪術揮發油得率提高，當酶添加量達到1.5%時，得率為4.53%，再進一步添加纖維素酶，得率并沒有顯著變化，說明此時酶已達到飽和狀態。故選擇1.5%為最適酶添加量，見圖1。

溫度過高或過低，都不利于酶活性的發揮，纖維素酶輔助提取莪術揮發油的最適溫度為50 ℃，此時得率達到最大值4.48%，見圖2。

隨著pH增大，莪術揮發油得率提高，當pH為4.8時，得率達到最大值4.76%，再進一步提高pH，得率反而減小。故選擇pH 4.8為最佳酶解pH，見圖3。

隨著酶解時間的延長，莪術揮發油得率變大，當酶解時間為2.5 h時，得率達到4.26%，之后得率增幅很小，考慮到實際生產效率，故選擇2.5 h為最佳酶解時間，見圖4。

圖4 酶解時間對莪術揮發油得率的影響

3.2 響應面試驗

試驗結果見表2，方差分析結果見表3。通過回歸擬合，獲得莪術揮發油得率（Y）與自變量（酶添加量、酶解pH、酶解時間）的二次多項回歸方程：Y= -76.98+11.50A+34.93B-6.80C+0.75AB-0.18AC+4.04BC-4.51A2-4.88B2-2.65C2。回歸方程模型P＜0.000 1，失擬項不顯著（P=0.476 1），模型總決定系數R2=0.990 7，調整后Radj2=0.978 7，變異系數（C.V.）為3.03%，以上參數均說明該模型與試驗數據擬合程度好，試驗誤差小，可用于不同變量條件下的響應值預測。三個因素對莪術揮發油酶法輔助提取的影響均非常顯著（P＜0.01），其中酶解時間（C）影響最大，酶添加量（A）次之，酶解pH（B）影響最小。表3和圖5結果表明，BC間交互作用對酶法輔助提取莪術揮發油的影響非常顯著（P＜0.01），AB和AC間交互作用則對揮發油得率的影響不顯著（P＞0.05）。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 方差分析結果

通過求解回歸模型方程，得到莪術揮發油纖維素酶提取的最佳工藝：酶添加量1.6%、酶解pH 4.6、酶解時間2.1 h，在此條件下揮發油得率的理論值為5.29%。根據此工藝進行3次驗證試驗，獲得的揮發油得率均值為5.24%±0.31%，與理論值相對誤差為0.95%，說明回歸模型有效可靠。纖維素酶輔助提取的揮發油得率顯著高于單獨水蒸氣蒸餾法獲得的得率2.17%±0.46%，纖維素酶輔助提取莪術揮發油工藝具有實際應用價值。

3.3 抗氧化活性

如圖6和圖7所示，莪術揮發油的DPPH自由基和羥自由基清除率均隨著質量濃度的增加而明顯增大，當揮發油質量濃度為1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到82.75%，羥自由基清除率為72.94%。莪術揮發油對DPPH自由基和羥自由基的半數抑制質量濃度分別為0.783和0.814 mg/mL。結果表明莪術揮發油對DPPH自由基和羥自由基均有一定的清除作用，但其體外抗氧化活性弱于抗壞血酸。

圖6 莪術揮發油對DPPH自由基的清除作用

4 結論與討論

研究通過單因素試驗和響應面試驗獲得了纖維素酶輔助提取莪術揮發油的最佳工藝：酶添加量1.6%，酶解pH為4.6，酶解時間2.1 h，酶解溫度50 ℃，料液比1∶10 mL/g。在此條件下獲得的揮發油得率為5.24%，與理論預測值5.29%相對誤差小于5%，說明回歸模型有效可靠。纖維素酶輔助提取法的揮發油得率顯著高于單純水蒸氣蒸餾法的得率2.17%。趙海燕等[4,9]分別使用微波、超聲輔助提取法獲得廣西莪術揮發油的提取率，結果分別為5.18%和4.35%。蔡吉祥等[5]采用響應面試驗對微波輔助提取蓬莪術油的工藝進行優化，獲得的蓬莪術油得率為4.68%。羅莎等[10]研究發現超聲波前處理-微波法提取溫莪術的揮發油得率可達4.71%，高于超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾法的4.47%和2.53%。祝冬青等[11]采用水蒸氣蒸餾法獲得莪術油的得率為2.40%。研究采用纖維素酶輔助提取，揮發油得率高于上述文獻使用的方法，值得進一步研究推廣。

研究表明，天然植物如花椒籽、落新婦揮發油對DPPH和羥自由基具有較強的清除活性，可作為潛在的天然抗氧化劑進行開發利用[12-13]。研究也發現，莪術揮發油對DPPH和羥自由基具有較強的清除作用，對DPPH和羥自由基的半數抑制質量濃度分別為0.783和0.814 mg/mL，這一點與前期文獻結論一致[4,9]。研究通過優化莪術揮發油的纖維素酶輔助提取工藝，為莪術揮發油產品的進一步開發提供一定的理論基礎，莪術揮發油的抗氧化活性研究，對于開發天然來源的美白化妝品、食品抗氧化劑和保鮮劑有一定的指導作用。