山楂葉多糖提取工藝優化及體外抗氧化和抑菌活性研究

李杰，田思雨，譚怡然，趙嘉，周銘懿

1. 錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121001）；2. 遼寧省肉類加工與質量安全控制專業技術創新中心 錦州醫科大學（錦州 121001）

山楂葉為薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifidaBge.）的干燥葉，主產于我國華北、東北等地。山楂葉中富含各種生物活性物質，包括黃酮類、氨基酸、多糖、維生素、微量元素[1]。植物多糖的來源廣泛、高效且無毒副作用[2]。由于植物多糖被證實具有諸多生理功能，如免疫調節、抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等作用[3]，使得對其研究日益受到關注。目前對山楂葉中活性物質研究主要集中在黃酮類化合物提取、功能特性等方面，對多糖類物質的研究較少。

目前對多糖的提取多采用熱水提取、超聲輔助提取[4]、酶輔助提取及微波輔助提取[5-6]等方法。采用傳統熱水提取法對山楂葉多糖進行提取。采用單因素試驗對山楂葉多糖的提取條件進行優化，對提取次數、料液比、提取時間和提取溫度進行了考察，利用響應面法進行優化分析。同時通過測定DPPH·自由基和ABTS+自由基的清除率，探討山楂葉多糖的抗氧化能力。此外，還對山楂葉多糖的抑菌活性進行研究，以期為山楂葉作為天然抗氧化功能產品的進一步開發利用提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂葉（廣西桂林天堂漓江有限公司）；葡萄糖標準品（江西佰草源生物科技有限公司）；石油醚、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、抗壞血酸（天津市富宇精細化工有限公司）；DPPH·試劑、ABTS+試劑（上海研啟生物科技有限公司）；所有試劑均為分析純。

RE-2 000 B旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；DF-101 S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（韓國DAIHAN公司）；UV-1600紫外可見分光光計（上海精密科學儀器有限公司）；LC-20 a高效液相色譜儀（島津儀器蘇州有限公司）；SHZ-DⅢ予華牌循環水真空泵（陜西太康生物科技有限公司）；MIKRO220 R高速低溫離心機（德安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 山楂葉多糖提取

1.2.1.1 山楂葉的預處理

將鮮山楂葉在60 ℃干燥24 h，烘干后用粉碎機粉碎，然后將粉碎的山楂葉粉末過0.250 mm篩，并將過篩后的山楂葉粉末收集備用。稱取100 g處理好的山楂葉粉與2 L石油醚混合，室溫攪拌處理12 h，并重復3次。抽濾，將石油醚除去，即得除脂的山楂葉粉末，收集備用。

1.2.1.2 提取工藝

參考龔頻等[7]的方法稍作修改。準確稱取4 g脫脂后的山楂葉粉，在一定的料液比、提取次數、提取時間和提取溫度下提取粗多糖。然后離心（6 000 r/min，10 min）收集上清液，負壓濃縮后，向提取液中加入4倍體積的無水乙醇，在4 ℃過夜沉淀，離心后收集沉淀，并冷凍干燥即為山楂葉粗多糖。

1.2.1.3 標準曲線的繪制

參考Lin等[8]的苯酚-硫酸法。以葡萄糖作為標準品，來繪制標準曲線。精確稱取10 mg葡萄糖加蒸餾水，定容至10 mL容量瓶中，配制成 1 mg/mL葡萄糖標準溶液，備用。準確吸取0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL葡萄糖標準對照溶液，分別定容至10 mL容量瓶中。取各稀釋液1 mL于試管中，依次添加1 mL 5%的苯酚標準溶液、5 mL濃硫酸，充分混合后靜置30 min冷卻至室溫后，用蒸餾水作為空白對照，在490 nm波長處測吸光度，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。其標準曲線回歸方程為y=0.003 87x+0.006 75，R2=0.998。

1.2.1.4 多糖含量的測定

用1.1.2.3小節中的方法測定吸光度。并計算山楂葉粗多糖的得率，山楂葉多糖得率按式（1）計算。

式中：C為葡萄糖標準溶液質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為樣品溶液體積，mL，M為山楂葉粉質量，mg。

1.2.2 多糖提取工藝優化

1.2.2.1 單因素試驗

以粗多糖得率為指標，分析料液比、提取次數、提取時間和提取溫度四個因素對粗多糖得率的影響。固定各因素水平：料液比1∶40 g/mL，提取次數2次，提取時間2 h，提取溫度80 ℃。改變各因素水平參數：提取次數為1，2，3，4和5次時，分析提取次數對得率的影響；料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL時，分析料液比對得率的影響；提取時間為1，1.5，2，2.5和3 h時，分析提取時間對得率的影響；提取溫度為60，70，80，90和100 ℃時，分析提取溫度對得率的影響。根據單因素結果進行正交試驗，從而確定粗多糖的最佳提取工藝參數。

1.2.2.2 響應面試驗

根據單因素試驗的結果，對提取料液比、提取時間和提取溫度3個因素分別取3個水平進行響應面試驗，優化山楂葉多糖提取工藝。響應面試驗的三因素三水平選取見表1。

水平 因素A料液比/(g·mL-1) B提取時間/h C提取溫度/℃-1 1∶30 1.5 80 0 1∶40 2.0 90 1 1∶50 2.5 100

1.2.3 體外抗氧化性測定

1.2.3.1 DPPH·自由基清除能力的測定

參考張婉君等[9]測定方式并進行修改。分別取不同質量濃度梯度（0.5，1，2，3，4和5 mg/mL）的多糖溶液與抗壞血酸于不同試管中，加入2.0 mL DPPH· 溶液，再加0.5 mL蒸餾水搖勻室溫避光靜置30 min，在波長517 nm下分別測定吸光度。按式（2）計算DPPH·的清除率。

式中：A0為空白溶液吸光度；A1為多糖或抗壞血酸溶液吸光度；A2為樣品溶液本底吸光度。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參考韋志等[10]的方法。取與1.2.3.1小節相同濃度梯度的多糖溶液進行試驗，以抗壞血酸VC為陽性對照，體積分數為95%乙醇與ABTS+工作液混合液為參比液，在波長734 nm處測定吸光度，進而計算粗多糖對ABTS+自由基的清除率，按式（3）計算。

式中：A0為空白溶液吸光度；A1為多糖或抗壞血酸溶液吸光度；A2為樣品溶液本底吸光度。

1.3 山楂葉多糖提取液對細菌生長的影響

用打孔器將濾紙打成直徑9 mm的圓濾紙片，與營養瓊脂培養基一同在121 ℃條件下滅菌20 min。制作培養基平皿，用無菌移液槍吸取菌懸液，涂布均勻。將滅菌后的濾紙片浸入山楂葉多糖的提取液中30 min，用無菌鑷子取出，晾干，平鋪于含有涂布細菌的凝固培養基中，倒置放在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。觀察測量抑菌圈的直徑。

1.4 數據處理

以上每個試驗重復3次，結果以平均值±標準差表示。采用響應面分析，Design Expert 13及Origin 2019軟件對試驗數據進行處理、方差分析及試驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取次數對山楂葉多糖得率的影響

由圖1的結果可知，提取次數從1次到2次的過程中多糖得率有所增加，提取2次之后多糖得率變化并不明顯。原因可能是提取2次能夠使得全部多糖溶出。所以固定提取次數2次。

2.1.2 料液比對山楂葉多糖得率的影響

由圖2可知，隨著液料占比不斷增大，山楂葉多糖的得率先升高后降低。料液比為1∶40 g/mL時，山楂葉多糖的得率最高，為8.33%。所以，最佳料液比為1∶40 g/mL。

2.1.3 提取時間對山楂葉多糖得率的影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，山楂葉多糖的得率呈現先升高而后降低的趨勢。當提取時間達到2 h時，多糖得率達到最大值，為8.63%。可能的原因是隨著提取時間的延長，其他物質溶出，導致多糖得率有所下降。因此，最佳提取時間為2 h。

2.1.4 提取溫度對山楂葉多糖得率的影響

由圖4可看出，溫度在60~90 ℃區間內，得率一直呈上升趨勢，且趨勢顯著。在90~100 ℃區間，得率上升趨勢趨于平穩，當溫度達到100 ℃時提取率達到最大值7.44%。因此選取100 ℃為最佳的提取溫度。

圖4 提取溫度對山楂葉多糖得率的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面優化試驗結果

根據單因素試驗結果選取料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）進行響應面試驗。響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

通過Design-Expert 13軟件分析試驗數據，得二次多項回歸方程：得率Y=8.66+0.423 8A+0.453 8B+ 0.412 5C+0.04AB+0.007 5AC+0.002 5BC-0.704 5A2-0.599 5B2-0.677C2。模型顯著，具有統計學意義。

方差分析結果見表3。模型決定系數R2為0.997 6，模型顯著性較高，Radj2=0.994 4，能夠解釋試驗響應值變異的97.64%，接近預測相關系數PredR2，表明試驗模型與實際數據擬合較好。

2.2.2 各因素的交互作用分析

圖5~圖7為各個因素之間兩兩交互作用的響應面圖和等高線圖。圖5為料液比和提取時間的交互作用對多糖得率的影響。料液比在1∶30~1∶50 g/mL范圍內，提取時間在1.5~2.5 h范圍內時，多糖得率的變化趨勢為先增加后降低，二者交互作用使得多糖得率達到最大值8.69%±0.001 2%。

圖5 料液比和提取時間的交互作用對多糖得率的影響

圖6為料液比和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響。料液比在1∶30~1∶50 g/mL范圍內，提取溫度在80~100 ℃范圍內，隨著料液比和提取溫度的持續增加，多糖得率先增加后降低，二者交互作用使得多糖得率達到最大值8.73%±1.46%。

圖7為提取時間和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響。提取時間在1.5~2.5 h范圍內，提取溫度在80~100 ℃范圍，隨著提取溫度和提取時間的升高，多糖得率均先增加后降低，兩者交互作用使得多糖得率最大值達到8.68%±0.002%。

圖7 提取時間和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響

根據Design-Expert 13軟件運行結果，在料液比、提取時間、提取溫度的共同影響下，最優提取工藝為料液比1∶43.136 g/mL、提取時間2.195 h、提取溫度93.072 ℃，該條件下模型預測的得率達到8.882%。

2.2.3 最優工藝條件試驗驗證

結合實際操作的可行性，在提取次數2次、料液比1∶43 g/mL、提取時間2.2 h、提取溫度93 ℃條件下進行3次重復試驗，平均提取率為8.916%±0.005%，與模型預測結果較吻合，表明響應面模型用于分析優化得率的最佳工藝有效可行。

2.3 山楂葉多糖的體外抗氧化活性

山楂葉多糖的體外抗氧化活性結果如圖8所示。ABTS+和DPPH·自由基清除率在0~5.0 mg/mL范圍內，都是隨著多糖濃度的升高，其自由基清除率逐漸升高。當多糖質量濃度達到5.0 mg/mL時，ABTS+自由基的清除率為46.24%±0.26%，與VC相比相差較大。而DPPH·自由基的清除率可達到70.18%±0.04%。結果表明山楂葉多糖具有良好的抗氧化活性。

圖8 DPPH·自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力

2.4 山楂葉多糖的抑菌效果

對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種細菌進行抑菌試驗，由表4可看出，在圓濾紙片的周圍均出現抑菌圈，說明山楂葉多糖提取液對這3種細菌的生長都有抑制作用。從抑菌圈直徑大小可以看出，山楂葉多糖對大腸桿菌的抑制作用最明顯。

表4 山楂葉多糖對細菌的抑制試驗

3 結論

此試驗研究了山楂葉多糖的提取工藝條件及其抗氧化活性和抑菌活性。通過單因素試驗及響應面優化試驗結果可得出：提取山楂葉多糖的最優工藝條件為提取次數2次、料液比1∶43 g/mL、提取時間2.2 h、提取溫度93 ℃，此時山楂葉多糖的平均提取率為8.916%±0.005%，與響應面模型預測值相符。

山楂葉多糖對DPPH·和ABTS+都有清除能力，ABTS+自由基的清除率為46.24%±0.26%，DPPH·自由基的清除率可達到70.18%±0.04%。抑菌試驗研究結果表明，在最優的提取工藝條件下，山楂葉多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都起到抑制作用，但抑制的程度并不相同。