拓木的防腐作用及其在薄片中的應用

韓航航，鄧寶安，何媛，王芳，趙龍，張增輝

陜西中煙工業有限責任公司技術中心（西安 710065）

柘木，中藥名，為桑科柘屬植物柘樹Maclura tricuspidataCarrière [Cudraniatricuspidata（Carr.）Bur. ex Lavallee]的木材。柘樹分布于我國華東、中南、西南及河北、陜西、甘肅等地，具有滋養血脈，調益脾胃之功效[1-2]，主治虛損，婦女崩中血結，瘧疾。拓木樹葉富含活性物質，如黃酮、皂苷和多糖，并具有免疫調節、降血糖、防腐、抗炎、抗氧化和抗病毒活性[3-4]。然而，由于每年大量使用，拓木廢物的處理成為嚴重的環境問題[5-6]。拓木樹葉中含有豐富的活性物質。因此，可采取循環利用策略，促進拓木副產物的潛在創新應用和拓木資源的開發利用。

拓木黃酮作為一種重要的黃酮類化合物，是由植物、蔬菜和水果產生的一種次生代謝物，由2個苯環和酚羥基通過中心三碳鏈連接形成的一系列化合物組成[7-8]，已確定8 000余種黃酮類化合物。根據B環的連接位置、中心三碳鏈的氧化程度和環的形成的特征，拓木黃酮在許多植物的防腐、抗炎、抗癌、抗病毒糖尿病和抗氧化特性中發揮重要作用。

植物提取物（如黃酮）因其天然防腐、抗菌和抗氧化活性而被廣泛研究，其在霉菌毒素污染和氧化酸敗導致的食品變質中的應用研究被各國研究人員密切關注。據聯合國糧農組織（FAO）統計，全球每年約有25%的谷物受到不同程度的真菌毒素污染，每年超過5 000萬 t的谷物不能食用，直接經濟損失達1 400億美元。多種中毒癥狀可由人類或動物攝入被真菌毒素污染的農業和牲畜產品，以及吸入和皮膚接觸真菌毒素引起。同時，酸敗過程中產生的有害過氧化物和自由基會對人體健康造成嚴重危害，如炎癥、衰老、過敏反應、癌癥等發病率增加。防腐劑和抗氧化劑通常在食品加工、儲存和保存過程中添加，以獲得較長的保質期。合成防腐劑，如苯甲酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀等被廣泛應用于薄片生產中；合成抗氧化劑，如丁基化羥基茴香醚（BHA）和丁基化羥基甲苯（BHT）被廣泛應用于食品生產和加工中。然而，研究表明天然防腐劑（如黃酮）一般對人體無毒害，并能增加薄片的品質特征；合成抗氧化劑的廣泛使用可能會導致肝損傷和癌癥。試驗通過評估拓木樹葉作為食品防腐劑和抗氧化劑的天然來源生物活性，以鼓勵循環利用并減少廢物處理對環境的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

拓木樹葉（采自中國張家口崇禮區拓木苗木種植農民專業合作社種植基地，將樣品干燥并研磨成直徑0.2~0.4 nm碎片）；馬鈴薯葡萄糖（PDA）、麥芽提取物（MEA）瓊脂，均購自國藥集團（上海）。電熱鼓風干燥箱，上海一恒公司；AL2002電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；UV5紫外可見分光光度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；使用的所有其他化學品和溶劑均為分析級。

1.2 提取和測定

總黃酮和皂苷的提取采用文獻[9]的方法。在75%乙醇、液固比20∶1 mL/g、超聲功率100 W條件下提取60 g拓木樹葉干粉，測定總黃酮和皂苷含量。這個過程重復2次。旋轉蒸發后，將粗提取物溶解在純凈水中，并用系統溶劑提取，得到石油醚（PEF）、乙酸乙酯（EAF）、正丁醇（BF）和水（AF）部分。用AB-8大孔樹脂和不同體積分數的乙醇（0，30%，50%，70%和95%）分離和純化EAF，50%乙醇洗脫液分離純化所得物質為皂苷。用D101大孔樹脂和不同體積分數的乙醇（0，30%，50%，70%和95%）分離純化BF，50%乙醇洗脫液分離純化得到的物質為總黃酮（0.169 g）。

采用水提醇沉法從拓木樹葉中提取多糖。將拓木樹葉的干燥粉末（5 g）用蒸餾水提取2 h。將提取物過濾并濃縮至20 mL，加入4倍體積的無水乙醇，并置于冰箱中過夜沉淀，獲得粗多糖（0.747 g）。

用無水乙醇和無菌水將黃酮、皂苷和多糖溶解到100.0 mg/mL儲備溶液中，通過二倍稀釋法稀釋至50×，25×，12.5×和6.25×。

1.3 抗真菌測試

試驗使用的測試菌株黃曲霉、桔青霉、黑曲霉、串珠鐮刀菌、米根霉和哈茨木霉為食源性致病菌。所有真菌在相應的培養基上于28 ℃培養48 h，并傳代培養3次。PDA是桔青霉、黑曲霉、哈茨木霉和串珠鐮孢的適宜培養基，MEA是黃曲霉和米曲霉的適宜培養基。

提取物的抗真菌活性采用菌絲生長速率法進行檢測[8,10]。將不同的提取物與PDA/MEA培養基混合以獲得質量濃度為10，5，2.5，1.25，0.625和0.312 5 mg/mL的固體板。PDA/MEA培養基為陽性對照，酮康唑為陰性對照。在28 ℃下培養真菌餅48 h后，計算菌落直徑（d）。抑制率按式（1）計算。根據生物計量值轉換機會表計算提取物的半最大有效濃度（EC50）和回歸方程。

1.4 抗氧化活性測試

拓木樹葉提取物（多糖、黃酮和皂苷）的自由基清除活性表示為DPPH和ABTS+自由基形成的抑制率。根據文獻[10]的方法降低功率。使用濃度確定回歸方程，并計算抑制率和EC50值。VC作為陽性對照。

1.5 黃酮含量分析

通過前期研究的方法測定提取液中的黃酮含量。因此，將測試溶液與不同體積的75%乙醇、5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁和4%氫氧化鈉溶液混合，并孵育15 min。在波長510 nm處測量吸光度。通過蘆丁的校準曲線計算黃酮含量（蘆丁g/g樣品）。

1.6 拓木黃酮類在薄片中的防腐應用

將PDA和MEA培養基按1︰1混合，分別將混合霉液定量加入含有化學防腐劑（0.1%苯甲酸鈉）或5 mg/mL拓木黃酮類的煙草粉末中，搖勻后利用稠漿法制成薄片，置于37 ℃培養，定量取樣，用平板菌落計數法測定活菌總數，并繪制曲線。

2 結果與討論

2.1 抗真菌活性測定結果與分析

測試5種濃度（10，5，2.5，1.25和0.625 mg/mL）的黃酮、皂苷和多糖粗提物對黃曲霉、桔青霉、黑曲霉、串珠鐮孢、米曲霉和哈茨木霉的抑制作用（圖1）。圖1顯示，在測試的濃度范圍內，與皂苷和多糖相比，黃酮類化合物表現出顯著的抗真菌活性。用黃酮處理的真菌菌落的直徑明顯小于陰性對照的直徑，從而表明黃酮類呈現潛在的抑制作用。ANOVA結果顯示，不同提取物的5個濃度之間在P＜0.05時有顯著差異。

圖1 拓木樹葉提取物的抗真菌活性

黃酮類化合物，尤其是對黃曲霉，在0.625 mg/mL時抑制率為56.66%，在測試濃度下表現出不同程度的抑制作用（圖2）。此外，在5 mg/mL濃度下，對6種供試真菌的抑制率均達100%。結果表明，拓木樹葉黃酮對供試真菌具有顯著抑制活性。

圖2 拓木樹葉總黃酮的抗真菌活性

將拓木樹葉黃酮的質量濃度和相應的抑制率分別轉換為對數值和概率值，以獲得毒性回歸方程，并計算EC50（表1）。EC50是指引起50%最大效應的濃度，濃度低對應抑制作用強。黃酮類化合物對黃曲霉、桔青霉、黑曲霉、串珠鐮孢、米曲霉和哈茨木霉的EC50分別為0.901 2，1.112 5，1.106 7，1.180 2，1.152 7和0.921 5 mg/mL。結果表明，拓木樹葉黃酮抑制作用最強和最弱的真菌分別是黃曲霉和稻曲病菌。

表1 拓木樹葉總黃酮對6種供試真菌的毒性回歸方程及EC50值

2.2 抗氧化活性測定結果與分析

在DPPH、ABTS+和FRAP上測試5種濃度（5，2.5，1.25，0.625和0.312 5 mg/mL）的不同提取物的抗氧化活性（圖3）。圖3顯示，黃酮類化合物和皂苷類化合物在測試的濃度范圍內表現出顯著的抗氧化活性。黃酮的DPPH、ABTS+和FRAP活性分別相當于1.25，5和1.25 mg/mL的維生素C。ANOVA結果顯示，不同提取物的五個濃度之間存在0.005水平的顯著差異。回歸方程和EC50值列于表2。DPPH、ABTS+和FRAP黃酮的EC50分別為0.150 2，0.031 2和3.182 6 mg/mL。結果表明，拓木樹葉黃酮具有顯著的抗氧化活性。

表2 拓木樹葉黃酮抗氧化活性的回歸方程和EC50值

圖3 拓木樹葉提取物的抗氧化活性

活性導向分離是一種經濟的技術，已被成功地用于鑒定、分離和純化植物代謝物，這些代謝物具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤的特性。與粗提物相比，活性導向分離的餾分顯示出更高的生物活性[7-10]。在抗氧化活性基礎上，對拓木樹葉總黃酮進行分離純化，篩選出2種抗氧化活性較強的黃酮類化合物，即異槲皮苷和拓木甲苷。此外，植物源黃酮類化合物是一類天然產物，因其抗菌作用而受到廣泛關注。有研究表明，植物來源的黃酮類化合物，如金盞菊和藏紅花提取物，具有令人滿意的抗真菌效果[9-10]。研究拓木樹葉提取物對6種食源性真菌的抑制活性，闡明其在天然食品防腐劑開發中的潛在應用。

2.3 拓木黃酮類與化學防腐劑在薄片中抑菌防腐效果比較

由圖4可知，在薄片中拓木黃酮添加量為5 mg/mL時能較好抑制黃曲霉和桔青霉等6種食源性致病菌的生長，其抑菌防腐效果明顯優于0.1%的苯甲酸鈉（P＜ 0.05），且在薄片中拓木黃酮類與化學防腐劑的抑菌防腐效果間的差異隨著時間的延長而越明顯。由于黃酮類化合物分子結構上含有較多的酚羥基，可與細胞膜上的蛋白質或酶類通過氫鍵方式結合，破壞蛋白質分子結構而變性甚至失去活性，導致細胞解體[11]。隨著人們對食品安全和營養要求的提高，傳統化學防腐劑的使用受到挑戰，拓木黃酮類可以有效用于薄片的防腐保藏，延長其貯藏期，且不損害薄片的香味物質和品質，因此可將其作為食品天然防腐劑代替化學防腐劑苯甲酸鈉或山梨酸鉀。

圖4 拓木黃酮類與化學防腐劑在薄片中抑菌防腐效果

3 結論

拓木是我國的一個藥食同源物種，具有多種生物活性。試驗評價拓木樹葉作為食品天然防腐劑和抗氧化劑來源的再利用潛力。身體的新陳代謝產生許多活性氧（ROS）和活性氮（RNS）物質，它們對酶、蛋白質和DNA產生不利影響，從而引起生理失衡，最終導致許多疾病。抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）可清除體內的自由基。而一旦機體免疫力減弱或被有毒物質侵入，如Cd、Hg等，體內的抗氧化劑就無法徹底清除自由基，而攝入富含抗氧化劑的食物可以彌補這一不足。值得注意的是，人工抗氧化劑在食品工業中的廣泛應用可能會導致肝損傷和癌癥，而拓木黃酮類具有較好的抗氧化活性，因此可將其開發為綠色健康的抗氧化劑。拓木黃酮類對黃曲霉和桔青霉等6種食源性致病菌均有較好的抑制作用，其作用機制是通過破壞細胞膜結構和在細胞內產生大量ROS，致使細胞內發生明顯的氧化應激而達到優良的抑菌效果，且拓木黃酮類抑菌防腐效果明顯優于常用化學防腐劑苯甲酸鈉。試驗通過評估拓木樹葉提取物的抗氧化和抗真菌活性和在薄片中的防腐效果應用，為從拓木副產品中開發天然抗氧化劑和防腐劑提供一種可能的創新應用，鼓勵回收利用，減少廢物處理對環境的影響，并可為從拓木樹葉中開發天然食品抗氧化劑和防腐劑提供潛在的創新應用。