基于模式識別技術結合UPLC的西紅花產地鑒別

管彬彬，熊金恩，李克慶，朱琳，蔣凡

南通市食品藥品監督檢驗中心（南通 226006）

西紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，是一種名貴的藥食同源產品，用途廣泛，在一些歐洲國家，如法國、西班牙、希臘等地區，西紅花常被作為不可或缺的食品添加劑和香料。在中國，西紅花是特別珍貴的中藥材和膳食材料，具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效，其有效成分包括西紅花苷、苦番紅花素和藏紅花醛等[1-3]。其中西紅花苷是西紅花色澤主要來源，具有活血、養顏、降血脂等作用；苦番紅花素是西紅花的主要呈味物質，具有消炎、抗腫瘤等作用；藏紅花醛是西紅花香氣的主要來源，具有緩解心肌損傷、抗氧化應激等作用[4-6]。以上幾種成分賦予西紅花明媚的色彩、獨特的香氣和味道，集觀賞、藥用和經濟價值于一身。

因為藥材在某一地域特定的自然生態環境下，加之較為集中的栽培、生產、加工技術，使其品質優良、療效確切，因此中藥素來有“道地藥材”一說，產地的“道地性”在很大程度上也是中藥材品質的保證[7-8]。西紅花的原產地位于西亞中東地區，主要分布在地中海沿岸以及歐洲，再經印度到西藏傳入我國，故又被稱為“藏紅花”或“番紅花”。在20世紀80年代，我國進行了引種栽培，在上海、江蘇、浙江以及河南等地實現了規模化的種植[9-11]。目前西紅花在各個國家及地區都有規模化的培育和種植，但是也正是由于受到產地及種植方式等差異的影響，各產地的西紅花藥材品質和質量也存在差異[12-13]。此次研究以不同產地的西紅花為研究對象，通過UPLC分離和檢測其有效成分，結合模式識別，對產地進行區分。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

西紅花樣本分別購自于上海、江蘇、浙江、伊朗、西藏5個地區，共29批，每批樣品取3份，共87份樣品，具體樣品信息見表1。

Waters H-class超高效液相色譜系統（美國沃特斯）；KQ5200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius CPA225D電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；Milli-Q Academic超純水機（密理博上海公司）。

對照品西紅花苷Ⅰ（批號111588-201704，含量以88.4%計）、西紅花苷Ⅱ（批號111589-201705，含量以92.2%計）、苦番紅花素（批號112056-202102，含量以97.3%計）：中國食品藥品檢定研究院；藏紅花醛[純度≥99.5%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]。

乙腈（默克股份有限公司）為色譜純，乙酸（西隴科學股份有限公司）為優級純，乙酸銨（西隴科學股份有限公司）、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；流動相A為0.05 mol/L乙酸銨水溶液（含0.05%乙酸），流動相B為乙腈，流動相梯度程序見表2。

表2 流動相梯度程序

進樣量為1 μL；西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的檢測波長為440 nm，苦番紅花素的檢測波長為254 nm，藏紅花醛的檢測波長為308 nm[14-15]。

1.2.2 樣品預處理

精密稱取40 mg西紅花藥材粉末，置于100 mL棕色量瓶中，加入90 mL 70%乙醇水溶液，冰浴超聲20 min后放至室溫，再以初始流動相比例A-B（90∶10，V/V）定容，搖勻，用0.22 μm的有機濾膜過濾后即得。

1.2.3 對照品溶液的制備

分別取適量對照品西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛，精密稱定，置10 mL量瓶中，以初始流動相（A-B=90∶10，V/V）配制成質量濃度約為0.4 mg/mL的對照品儲備液，再用70%乙醇分別稀釋成質量濃度為0.181，0.363，0.904，1.809，3.617，9.043，18.087和90.433 μg/mL的西紅花苷Ⅰ系列標準溶液，質量濃度為0.197，0.394，0.984，1.968，3.935，9.838，19.675，98.377 μg/mL的西紅花苷Ⅱ系列標準溶液，質量濃度為1.718，3.436，6.871，17.178，34.355，68.710和171.776 μg/mL的苦番紅花素系列標準溶液，以及質量濃度為0.380，0.950，1.900，3.800，9.500和19.000 μg/mL的藏紅花醛系列標準溶液，分別以液相色譜圖的峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 線性關系

利用UPLC對不同產地的西紅花中的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛進行分析，以上色譜條件能將以上成分完全分離，理論塔板數按所測各成分色譜峰計均不低于10 000，分離度均不小于1.5，對照品和樣品色譜圖分別見圖1和圖2。其中：西紅花苷Ⅰ的回歸方程為Y=2.105×107X+4.623× 103，r=0.999 9，線性范圍為0.181~90.433 μg/mL；西紅花苷Ⅱ的回歸方程為Y=2.604×107X+3.941×103，r=0.999 9，線性范圍為0.197~98.377 μg/mL；苦番紅花素的回歸方程為Y=3.325×106X-2.921×103，r=1.000 0，線性范圍為1.718~171.776 μg/mL；藏紅花醛的回歸方程為Y=1.224×107X-3.080×102，r=1.000 0，線性范圍為0.380~19.000 μg/mL。

圖1 混合對照品溶液色譜圖

圖2 樣品液相色譜圖

2.2 精密度

取編號為S1的西紅花樣品，按1.2.2小節進行樣品預處理后上機，分別于1天內連續進樣6次和連續3 d內重復進樣3次，西紅花苷Ⅰ的日內精密度和日間精密度分別為0.98%和1.01%，西紅花苷Ⅱ的日內精密度和日間精密度分別為0.34%和1.27%，苦番紅花素的日內精密度和日間精密度分別為0.92%和1.68%，藏紅花醛的日內精密度和日間精密度分別為1.08%和1.77%，精密度良好。

2.3 回收率

取3份已知含量的編號為S1的西紅花樣品，每份20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，分別精密加入相當于樣品成分量100%的各對照品溶液，按1.2.2小節進行樣品預處理后上機測定，西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛的回收率分別為100.01%，100.10%，99.46%和98.00%，SRSD分別為0.14%，0.04%，0.78%和0.40%。

2.4 樣品測定結果

將UPLC測得的87份樣本的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛四種成分峰面積，代入標準曲線，并折算其干燥失重后，得到各樣本中的各自含量，如表3所示。從表3可以看出，不同產地的西紅花樣本中的成分存在一定差異。浙江和上海的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ較為接近，均高于其他地區，其中浙江的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ平均含量最高，西藏和伊朗的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量較為接近，均比較低，這可能是由于浙江、江蘇和上海的西紅花多為大棚種植，而伊朗和西藏多為露天種植的原因；浙江產的苦番紅花素的含量遠高于其余產地，江蘇和上海產的含量接近；藏紅花醛含量江蘇產的西紅花含量最高，伊朗和上海的較為接近，浙江和西藏的藏紅花醛含量均比較低，這可能與當地的加工工藝有關。

2.5 方差分析

分別對5個不同產地的西紅花4種有效成分進行單因素方差分析，結果見表4。從表4可以看出，上海、江蘇、浙江、西藏、伊朗的西紅花樣本中的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛這4種成分含量均存在顯著性差異，P值均小于0.01。

表4 不同產地西紅花有效成分差異方差分析表

2.6 主成分分析

圖3是不同產地西紅花樣本中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛的含量進行主成分分析后前3個主成分的得分圖，是校正集中的西紅花樣本在該三維平面上的投影。可以看出，第一主成分（PC1）的貢獻率為97.58%，第二主成分（PC2）的貢獻率為2.40%，第三主成分（PC3）的貢獻率為0.01%，不同產地的西紅花在圖上有一定的分類趨勢，上海的西紅花樣本能和其他產地樣本完全分開，浙江和江蘇的西紅花樣本也有一定的聚類趨勢，但是兩省樣本有一定的重疊，西藏的西紅花樣本投影點分布比較分散，和伊朗的西紅花樣本有一定重疊，這是由于通過UPLC測得的西藏和伊朗的西紅花樣本中的有效成分含量均比較接近，投影點分布交叉較多。

2.7 模式識別

以不同產地的西紅花樣本的主成分得分向量作為線性判別（LDA）模型的輸入，進行LDA分析。從圖4（a）可以看出，當主成分因子數（Pcs）為2時，西紅花產地鑒別的訓練集和預測集的識別率均為最高，分別為81.03%和86.21%，預測集樣本中有4個樣本判別錯誤，其中有2個浙江的西紅花樣本誤判為江蘇，1個西藏的西紅花樣本誤判為伊朗，1個伊朗的西紅花樣本誤判為西藏。將不同產地的西紅花樣本的主成分得分向量作為K臨近（KNN）模型的輸入，進行KNN模型分析，當K值為1，主成分數為3時，模型的預測集識別率最高，為100%，此時訓練集的識別率為96.55%。

圖4 不同產地西紅花樣本的LDA（a）和KNN（b）模型識別率

3 結論與討論

文章建立了一種基于UPLC法同時定量檢測不同產地西紅花樣本中西紅花苷Ⅰ（保留時間3.909 min）、西紅花苷Ⅱ（保留時間4.232 min）、苦番紅花素（保留時間3.235 min）、藏紅花醛（保留時間11.751 min）這4種有效成分的方法，還可通過該方法同時鑒別西紅花樣本中是否添加檸檬黃（保留時間0.820 min）、新品紅（保留時間5.118，5.702和6.551 min）、金胺O（保留時間5.210和6.222 min）、胭脂紅（保留時間2.547 min）等色素，色譜圖中峰形對稱無干擾，分離度均大于1.5。從方差分析結果看，試驗不同產地樣本中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛的含量均存在顯著性差異。將UPLC測得的4種有效成分主成分分析后的得分向量作為模式識別的輸入，進行LDA、KNN模式識別，結果表明KNN模型的效果更加，當主成分數為3，K值為1時，模型的訓練集和預測集的識別率分別為96.55%和100%。結果表明模式識別技術結合UPLC的西紅花產地鑒別是可行的。此次試驗結果，發現不同產地的西紅花中的有效成分存在顯著性差異，但要使模型更加準確可靠，還需收集更多數量的西紅花樣本，此外，還需進一步研究不同產地西紅花樣本含量不同的原因，以便后期整體提高西紅花的質量。