魚加工副產物酶法制備低聚肽的研究進展

葛風茹，鄢烽，宋琨燕，楊子祥，付桂明，鄭洪立

南昌大學食品學院（南昌 330047）

低聚肽由蛋白質降解后形成，一般含有2~10個氨基酸殘基，以肽鍵相連，分子量在1 500 Da以下，是低分子量生理活性肽，也稱為寡肽或小分子活性肽。肽鍵是由一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸上的羧基脫水縮合形成（圖1）。低聚肽根據氨基酸殘基數量分為二肽、三肽和四肽等。1953年Agar等[1]首次發現肽可以被腸道利用，這一發現打破了傳統的蛋白質消化認知學說，即小腸中蛋白質的消化產物為氨基酸[2]。隨后研究發現了低聚肽，此后研究人員圍繞低聚肽開展了大量的研究工作，人們對低聚肽的認識越來越深入，實現了低聚肽工業化應用。

圖1 肽鍵的形成示意圖

低聚肽的制備方法包括提取法、合成法以及大分子降解法[3]。提取法是根據低聚肽溶解能力及溶劑極性不同，使用單種或多種溶劑組合提取低聚肽的方法。該法較早建立，較為簡便；但規模較小，工藝落后，得到的低聚肽質量不高[4]。合成法是指通過化學方法或生物催化劑的手段合成低聚肽。此法條件溫和，反應專一，但合成條件要求高，效率較低[3,5]。大分子降解法是指通過物理、化學以及生物等手段降解蛋白質分子制備得到低聚肽的方法。原料通常包括來源于生物的蛋白。植物蛋白來自茶葉、核桃、大豆以及綠豆等。動物蛋白來自牡蠣、海參、龜類以及魚類等。微生物蛋白包括酵母、谷氨酸菌體等蛋白。通過物理、化學手段降解蛋白質制備低聚肽，反應迅速；反應過程難以控制，低聚肽得率較低。生物降解法又分為微生物發酵法和酶法，其中微生物催發酵法本質上是利用微生物分泌的蛋白酶降解蛋白質，微生物種類繁多，分泌的酶種類也多，低聚肽得率較高，但后期分離目標產物困難且反應易受雜菌污染。酶法反應專一迅速，條件溫和，低聚肽回收率較高。魚加工副產物酶法制備低聚肽所采用的酶通常包括外源酶和內源酶。因此，文章將重點綜述魚加工副產物酶法（外源酶和內源酶）制備低聚肽及其催化機制，以期為我國魚加工副產物制備低聚肽的研究以及實際生產應用提供科學依據和理論參考。

1 低聚肽的功能及用途

1.1 低聚肽在食品方面應用

低聚肽具有顯著的生物活性，且可以直接被胃腸道吸收，作為保健食品、功能性食品等。低聚肽可以減少肉類氧化程度，延長肉制品保質期。研究人員發現低聚肽能夠有效促進鈣的吸收，提高大鼠對鈣的利用率[6]。研究發現核桃低聚肽（WOPs）可以提高植物乳桿菌的存活率，可以作為穩定劑添加至酸奶產品中。利用生物技術從天然蛋白質物料中制備的低聚肽具有良好的呈味功能，可用于食品調味。此外，高F值低聚肽因其獨特的氨基酸組成及生理功能，可以被添加至嬰兒配方奶粉食品中[7]。低聚肽分子量小，結構緊密，易于吸收，具有良好的溶解性及加工特性，可用于多種食品，如營養食品、臨床營養產品、糖果以及飲料，也可用于醬汁、湯、沙拉醬、肉類加工等其他食品產品，使用方便且本身無味，不影響食品口感。

1.2 低聚肽在醫藥方面應用

低聚肽具有抗疲勞、延緩衰老、降血壓、防治糖尿病等功效，可以作為更安全有效的藥物以及醫用材料。低聚肽可保護小鼠的肝，減緩疲勞[8]。低聚肽能夠有效清除體內過量的自由基以及有害物質，修復細胞，有效防止機體衰老[9]。低聚肽還可以激活免疫活性，具有抑菌作用，能夠有效提高機體對外界病原體感染的抵抗作用。研究人員發現低聚肽可以通過調節抗凋亡信號通路預防肝細胞凋亡，改善高脂肪飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病[10]。此外，低聚肽能夠調節血壓，降糖降脂，具有改善糖尿病的作用。

1.3 低聚肽在日化領域應用

低聚肽為化妝品研究和應用提供新方向和新思路，其功能越來越細分。低聚肽具有選擇性、有效性、安全性和耐受性等特點，被廣泛應用于抗氧化、保濕、抑菌等方面。低聚肽在化妝品中的應用不斷增加，低聚肽產品的種類和數量增加了80%以上[11]。低聚肽具有抗氧化、自我更新等作用，是抗衰老化妝品的理想選擇。體內和臨床研究表明，含有生長因子、細胞因子、基質因子或基質因子樣肽的化妝品可以促進皮膚年輕化并改善皮膚通透性[12]。國外研究人員從藍藻中提取了多種低聚肽代謝物，被廣泛應用于抗皺劑、防曬霜、保濕劑和其他護膚品中[13]。已有研究表明：低聚肽也可用于化妝品，如抗皺、美白等；這是老年人皮膚化妝品的組成部分[14]。

2 魚加工副產物概述

地球上水體面積占地球表面積的71%以上。水體中蘊藏著大量的魚類資源，我國有魚類約3 000種，魚類資源非常豐富。2019年我國魚類產品總量約為4 000萬 t；其中海洋魚類產品總量約1 000萬 t，淡水魚類產品總量約3 000萬 t；魚類產品加工總量約為1 000萬 t，形成大量的副產物。魚含豐富的蛋白質，如膠原蛋白、肌原纖維蛋白、肌基質蛋白、血藍蛋白、肌球蛋白等，所含氨基酸類型豐富，包含人體必需氨基酸，如賴蘇氨酸等，且氨基酸模式是比較均衡的，故魚的蛋白質可作為生產低聚肽的良好原料。不同魚類含有的必需氨基酸組成不同，制備得到的低聚肽具有多樣性。

魚頭、魚骨、魚內臟、魚皮等魚加工副產物，約占魚總質量的40%~55%，魚頭約占25%，魚骨約占12%，魚內臟約占10%，魚皮約占5%[15]。魚頭富含蛋白質、脂肪、維生素、鐵、鋅等微量元素。魚骨是魚的骨頭，一般包括中椎骨、邊肋骨、腹背尾鰭。魚骨里含有蛋白質（膠原、骨膠原）、脂肪、水分以及豐富的鈣質和微量元素（鐵、鋅、銅等）。魚內臟主要含脂肪、蛋白質、維生素等。魚皮是指魚的毛被、表皮、硬鱗、真皮和皮下組織。魚皮富含膠原蛋白。在魚頭、魚骨等魚加工副產物中，魚頭占魚體總質量的比重最高，魚骨次之，魚皮最低。但不同魚其魚頭、魚骨、魚皮、魚內臟占魚體總質量的比例不同；同一種魚不同加工工藝得到的魚頭、魚骨、魚皮、魚內臟占比也不同。魚加工副產物富含蛋白質，以草魚為例，魚頭、魚骨、魚皮、魚內臟、魚鰭和魚鱗的蛋白質含量分別為13.8%，15.7%，22.5%，7.73%，16.1%和31.3%[16]。目前魚加工副產物，除部分用于飼料和化肥外，大量廢棄，這浪費了蛋白資源和污染了環境。如果可以合理利用這些蛋白質資源，一方面保護了環境，另一方面，可以提升廢棄物附加值，延伸產業鏈，推動經濟發展，因此研究開發魚加工副產物的蛋白資源制備低聚肽具有重要意義和價值。

3 酶法制備低聚肽

酶法是低聚肽制備的常用方法，也是一種公認的安全方法。因此，該方法所制備得到的低聚肽被廣泛應用于食品、化工和醫藥行業。魚加工副產物酶法制備低聚肽可采用的蛋白酶有外源酶和內源酶，目前以外源酶為主。通常，外源酶主要從植物（胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶）、動物（胰蛋白酶）、細菌（堿性蛋白酶和中性蛋白酶）和真菌（真菌蛋白酶）中獲得[17]。胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶均為內切酶。胃蛋白酶具有廣泛特異性，可作用于芳香族氨基酸或亮氨酸的氨基或羧基參與形成的肽鍵；胰蛋白酶具有特異性，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵；中性蛋白酶水解疏水性氨基酸殘基的肽鍵；堿性蛋白酶水解包含芳香族氨基酸殘基的肽鍵，特別是精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸等；木瓜蛋白酶具有低特異性，可作用于精氨酸、賴氨酸以及甘氨酸的羧基參與形成的肽鍵[18-19]。外源酶可以以游離酶和固定化酶形式降解魚加工副產物制備低聚肽。外源酶也可以以單酶和多酶降解魚加工副產物制備低聚肽。利用外源酶可高效、高純度制備低聚肽，但外源酶成本較高、酶容易失活。能夠降解魚蛋白的內源酶主要有組織蛋白酶、膠原蛋白酶、鈣蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，利用內源酶可低成本制備低聚肽。但內源酶的量往往有限，低聚肽制備的效率也較低。

3.1 外源酶

3.1.1 游離酶

目前魚加工副產物制備低聚肽所用的蛋白酶以游離酶為主，游離酶具有易溶于水、與底物接觸面廣、酶活高等優點，但存在與產物難分離、不能循環使用、易失活等缺點。應用較多的游離蛋白酶有堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、真菌蛋白酶等。首先，魚頭、魚骨、魚內臟、魚皮結構和化學組成差異明顯。其次，不同魚的魚頭、魚骨、魚內臟、魚皮等魚加工副產物不一樣。最后，同一種魚不同加工方式所產生的副產物也有差異。因此，不同魚加工副產物所采用的游離酶不同，且其加工工藝也不同。游離酶用于魚加工副產物制備低聚肽有不同的工藝，包括單酶和多酶水解法，見表1。

表1 魚加工副產物酶法制備低聚肽

單酶水解法是指通過添加單一蛋白酶降解魚加工副產物中蛋白質制備低聚肽的方法。單一蛋白酶分解蛋白質中特定結構的肽鍵，降解蛋白質，得到低聚肽。單酶水解法反應過程容易控制，反應條件相對簡單，反應速度快。不同蛋白酶切割位點不同，降解蛋白質后產生的低聚肽種類及活性也存在差異。魚加工副產物單酶制備低聚肽時，可以魚頭、魚骨、魚內臟、魚皮等魚加工副產物的混合物作為原料，這省去魚加工副產物混合物的分離環節。利用堿性蛋白酶將鲅魚加工副產物直接降解成血管緊張素轉化酶抑制肽[20]。魚加工副產物單酶制備低聚肽時，魚頭、魚骨、魚內臟、魚皮等也可以單獨作為原料。以中性蛋白酶等處理羅非魚加工副產物，最高水解度達31.86%，得到不同滋味肽，呈現不同風味[21]。在水解效果評價方面，單酶水解多用水解度表示，部分用自由基清除率表示。單酶水解魚蛋白效果并不好，且受底物結構影響較大。由于酶的專一性，單酶水解法只會分解蛋白質中特定結構的肽鍵，蛋白質水解不徹底。其降解蛋白質，水解度介于12.5%~45.5%之間。單酶水解反應不徹底，發酵液味苦，腥味較重，獲得的肽分子量較大，低聚肽不多。

多酶水解法是指多種蛋白酶共同降解蛋白質分子制備低聚肽的方法。多酶水解蛋白質，不同酶作用于蛋白質的不同位點，優勢互補，發揮不同酶各自的水解特性，有效提高蛋白質的降解程度；不同選擇性和特異性的蛋白酶組合，可以降解得到更多更小分子的肽。此外，多酶水解法因水解相對徹底，不易產生過重的腥味。多酶水解法分為混合酶水解法和分步酶解法。

混合酶水解法中酶的種類、比例對蛋白質的水解程度影響較大，影響所生成的低聚肽種類及結構?；旌厦杆夥ǖ乃舛容^單酶水解法高，見表1。中性蛋白酶和風味蛋白酶以1∶2混合水解鮐魚的蛋白質，最高水解度高達69.67%[23]。利用蛋白酶（用量1 200 U/g）和胰蛋白酶（用量2 400 U/g）混合酶降解馬面魚加工副產物魚皮制備血管緊張素轉化酶抑制肽，在4%魚皮、40 ℃、pH 8.0條件下，酶解4 h效果最好[24]。以0.8%的風味蛋白酶和堿性蛋白酶（1∶2）混合酶，在pH 8.5、55 ℃條件下反應4.5 h，魚鱗蛋白水解后游離氨基態氮含量為1.085 mg/100 mL[25]。廉志清等[22]研究發現將中性蛋白酶與木瓜蛋白酶按1∶1添加2%，在pH 6~7之間、60 ℃、酶解時間4 h條件下，魚鱗蛋白水解后肽收率可達89.6%。在水解效果評價方面，混合酶水解多用水解度表示，其次是游離氨基態氮含量以及肽收率。混合酶水解魚蛋白可能會出現酶的相互抑制作用，導致反應不夠徹底，獲得產物不多，且成本較高。

分步酶解法，即在反應第一階段用蛋白酶，使蛋白質降解為多肽鏈片段；第二階段添加肽酶進一步水解多肽鏈末端的氨基酸，縮短肽鏈。常用的蛋白酶包括胃蛋白酶和堿性蛋白酶。常用的肽酶包括風味蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶等。分步酶解法降解蛋白質不僅克服了單酶水解法水解不徹底的缺點，還在一定程度上預防了混合酶水解過程中多酶相互抑制的問題，同時還可以獲得含量更高的目標產物低聚肽。分步酶解法水解魚的蛋白質，由于不同酶的最適條件不同，反應過程中需改變反應條件，過程操作較為復雜。

酶的先后順序、添加量對蛋白質的水解程度有較大影響，同時影響生成低聚肽的種類及結構。用3%胃蛋白酶處理帶魚的蛋白質，在35 ℃、pH 2條件下酶解時間3 h后。再用3%風味蛋白酶繼續處理酶解液，在50 ℃、pH 7條件下再酶解3 h后，帶魚蛋白質的水解度為40.51%[26]。利用分步酶解法降解真鯛魚骨為低聚肽，酶解條件：5%底物濃度、pH 6.0、800 U/g胰蛋白酶、45 ℃酶解4 h，再加入3 000 U/g風味蛋白酶酶解4 h。水解度為42.91%[21]。酶解鰱魚加工副產物，第一步酶解條件：pH 7.0、2.5%中性蛋白酶、45 ℃水解5 h；第二步酶解的條件為2.0%風味蛋白酶、55 ℃水解3 h，得到含肽的魚露。分步酶水解通常用水解度和自由基清除率表示魚蛋白的水解效果。

3.1.2 固定化酶

針對游離酶容易被抑制、具有不穩定性、難以回收再利用、酶及其片段與食物結合容易導致過敏反應等問題，研究人員開展了酶固定化工作。以固定化堿性蛋白酶與中性蛋白酶（比例1∶1）降解魚加工下腳料，酶解條件：54.5 ℃、pH 8.2、45 min，得到的小于1 500 Da的低聚肽占比81.94%[22]。磁性交聯酶聚集體技術制備的固定化堿性和中性蛋白酶共同降解鳀魚加工副產物，酶解條件：54.1 ℃、pH 7.8、45 min，固定化堿性與中性蛋白酶比例為1.5∶1，得到小于1 500 Da的低聚肽占比77.27%[27]。研究發現酶固定化可以有效解決以上問題。酶的固定化是指將酶固定在多孔顆粒表面，防止酶之間相互作用或者酶與外界分子之間相互作用，可以有效提高酶的穩定性。此外，當酶是多聚體酶時，酶失活第一步是亞單位解離，通過固定化酶的亞單位將有效防止酶失活。研究發現酶的固定化還可以提高酶的活性，調節酶的選擇特異性[28]。因此，酶的固定化不僅可以實現酶的重復利用，而且有望成為酶應用于工廠生物催化劑的重要方法。固定化酶也存在阻礙反應、降低酶活等缺點。

就酶在載體上的附著模式而言，固定化機制可分為物理（例如通過范德華力吸附等）、化學（例如酶的載體和氨基酸殘基之間的共價鍵合和交聯等）和物理化學（例如微膠囊化等）方法[29]。胰蛋白酶、糜蛋白酶以及堿性蛋白酶等因在食品生產中的廣泛用途，在蛋白酶固定化研究中也較為常見。已有載體成功應用于胰蛋白酶的固定化，如聚（乙烯基胺）官能化二氧化硅微粒等。單一酶很難進行復雜的催化反應，而多酶催化的級聯反應允許進行復雜的反應。多酶催化不僅減少了底物的運輸和反應時間，還減少了由于擴散引起的中間損失，并產生了更少的副產物和污染物。然而，整合這種多酶催化系統來實現復雜的反應是困難的，因為不同種類的酶最佳使用條件是不同的。游離形式的多種酶難以回收，導致高成本和低生產效率，這限制了它們在工業應用中的使用。與單酶固定化相比，多酶固定化還可以簡化下游分離，容易產生較純的產品。

3.2 內源酶

能夠降解魚加工副產物中蛋白質為低聚肽的酶除了外源酶，還有內源酶。外源酶可以根據需要而添加不同種類的酶和不同用量，而內源酶則不然，這限制了內源酶在魚加工副產物中制備低聚肽工業上的應用。內源性蛋白酶通常以酶原形式存在于動物的內臟消化系統以及肌肉細胞中，在細胞凋亡程序啟動后被激活降解動物蛋白。魚中的內源性蛋白酶包括鈣激活蛋白酶、結締組織蛋白酶和溶酶體組織蛋白酶。魚類死亡后，細胞內離子強度增加，膜系統破裂，肌漿中鈣離子釋激活鈣激活蛋白酶，組織蛋白酶釋放到細胞質中，引起魚肉自溶和質構軟化現象[30]。

不同的內源性蛋白酶降解魚蛋白的作用位點不同。根據所需鈣離子濃度，鈣激活蛋白酶可分為μ- Calpain級和m-Calpain級，主要作用于魚肉蛋白疏水性氨基酸上，尤其是纈氨酸和亮氨酸。溶酶體組織蛋白酶包括B、H、L和D等。溶酶體組織酶B被認為是魚類死亡質地軟化的最主要原因。研究發現它可以快速降解肌間線蛋白，也可以降解肌球蛋白中的重鏈（MHC）。溶酶體組織蛋白酶H可作用于魚蛋白的疏水性氨基酸殘基，然而活性較低，一般認為對魚肌肉蛋白的降解作用忽略不計。溶酶體組織蛋白酶L可以降解魚的多種蛋白，包括肌球蛋白、肌鈣蛋白等。溶酶體組織蛋白酶D可優先切割魚蛋白的疏水氨基酸殘基，可以降解MHC，對魚肌原纖維蛋白的降解作用可以忽略不計[30]。

4 結語

隨著我國魚加工量的增加，魚加工副產物將不斷增加。魚加工副產物中蛋白質制備的低聚肽具有安全、分子量小、易吸收、相容性好等優點，也可以實現魚加工副產物的高值化轉化和利用。酶法因其環保、綠色、高效等優點，被廣泛應用于蛋白質水解領域。魚加工副產物酶法制備低聚肽展現出廣闊的應用前景。隨著酶工程和材料工程的不斷發展，魚加工副產物酶法制備低聚肽未來發展方向有如下三個方面：一是游離酶法水解魚加工副產物制備低聚肽時，酶降解過程的調控和酶解工藝的優化，減少降解過程腥味、苦味物質等的生成，同時降低酶的用量和成本。固定化酶法水解魚加工副產物制備低聚肽發展潛力巨大，需攻克固定化使酶活下降的難題。構建基于酶的高效反應器，包括攪拌罐式、流動床式和膜式反應器，實現低聚肽的連續化生產；同時加強對新型固定化酶技術及載體的探討，提高固定化酶活性，降低生產成本。二是發展基于超聲波、脈沖電場、微波輔助萃取以及亞臨界水水解等新興技術輔助的酶法降解魚加工副產物蛋白質制備低聚肽的技術和納米酶技術。納米酶是具有酶催化特性的納米材料，具有制備簡單、尺寸可控和功能可調的特點。隨著納米技術的發展，納米材料的優勢賦予了納米酶可調節的多功能性，發展潛力巨大。三是充分挖掘內源酶降解魚加工副產物蛋白質制備低聚肽的應用潛力，利用內源酶可以免去用酶成本。因此，利用我國豐富的魚加工副產物資源，深入研究魚加工副產物蛋白質制備低聚肽，有利于促進我國魚產業高質量發展。