豆芽發(fā)芽過(guò)程中黃酮類成分的檢測(cè)及變化研究

賈寒冰，王苑桃，何亞琴，孫曉，劉皖臻，李旸

西安市食品藥品檢驗(yàn)所（西安 710054）

大豆異黃酮是一類具有重要生物活性的化合物，在大豆及其制品中含量豐富，作為一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，伴隨大豆的生長(zhǎng)形成[1-2]。大豆異黃酮具有抗氧化作用，同時(shí)具有抗癌作用，作為一種類雌激素，大豆異黃酮具有改善婦女更年期綜合征、預(yù)防心血管疾病等生物活性和藥理活性[3]。自然界中異黃酮的資源有限，大豆作為重要的糧食作物，其大豆異黃酮含量在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上有重要意義[4]。

雖然大豆保健功效好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，但大豆同時(shí)含有植物凝集素、單寧、胰蛋白酶抑制因子、植酸[5-6]等，還有棉籽糖、水蘇等寡糖無(wú)法被吸收，影響人體對(duì)大豆中其他營(yíng)養(yǎng)素的吸收。將豆子泡發(fā)成豆芽后，大分子化合物分解成更易被消化吸收的小分子物質(zhì)[7]，豆腥味被降解[8]，大豆的適口性、營(yíng)養(yǎng)性和安全性得到改善；大豆中的生物活性物質(zhì)如維生素、皂苷、多肽、多酚類、大豆異黃酮和γ-氨基丁酸等含量增加[9]，加之發(fā)芽可使抗胰蛋白酶抑制劑含量降低，亦可使抗?fàn)I養(yǎng)素如半乳糖苷、植酸等的含量降低[10]，使大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用均提高。有研究表明，發(fā)芽的大豆，即黃豆芽，含有多種營(yíng)養(yǎng)素，和其他生物活性化合物一起，為人體健康提供良好物質(zhì)來(lái)源[11]。

已有研究報(bào)道豆芽中的大豆異黃酮物質(zhì)變化[12-13]，但大多數(shù)都是以染料木素為大豆異黃酮的代表[14]，而忽略豆芽中大豆異黃酮含量中重要的葡萄糖型大豆異黃酮種類，即大豆苷、大豆黃苷、染料木苷的含量變化，因此黃豆發(fā)芽過(guò)程中6種異黃酮含量變化幾乎為空白。試驗(yàn)旨在建立豆芽中6種大豆異黃酮類物質(zhì)，即大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素的檢驗(yàn)方法，并檢測(cè)不同發(fā)芽時(shí)間的豆芽中這6種大豆異黃酮含量及其變化，可為豆制品中異黃酮類物質(zhì)檢測(cè)提供方法，為評(píng)價(jià)黃豆芽所含功能性成分、更好確定黃豆芽的最佳食用時(shí)間等提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素混合標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.2%~99.8%，天津阿爾塔公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；二甲亞砜（分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）實(shí)驗(yàn)室用水（Milli-Q超純水）。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo公司）；ME204電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-700VDB型超聲波振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）；HC-3018R高速離心機(jī)（安徽中佳科學(xué)儀器有限公司）；pH計(jì)（瑞士Mettler公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

挑選顆粒飽滿、大小均勻，無(wú)殘缺、蟲(chóng)蛀的市售黃豆，用自來(lái)水清洗掉表面雜質(zhì)和灰塵，5倍水（W/V）浸泡24 h，浸泡后的大豆用自來(lái)水洗3遍，放入底部鋪2層紗布的器皿中，表面用2層紗布覆蓋，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)芽過(guò)程注意避光，每12 h用50 mL蒸餾水淋洗1次。定時(shí)取出豆芽放在40 ℃烘箱中烘干10 h。分別取干燥好的浸泡后的豆芽及發(fā)芽24，48，72和96 h的豆芽，用粉碎機(jī)粉碎，裝入清潔容器種并標(biāo)注好時(shí)間，放入-18 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素混合標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mL，用二甲亞砜溶液定容到10 mL，制成6種異黃酮類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。中間液用80%甲醇水溶液逐級(jí)稀釋，配制成1，2，5，8，10和20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)曲，定量方式為外標(biāo)法。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品，置于規(guī)格50 mL的容量瓶中，加入甲醇︰水=8︰2（體積比）的溶液到接近刻度線的位置，超聲波提取20 min，用同樣的溶液定容后，搖勻。將樣品溶液放置于離心管中，以8 000 r/min離心3 min，取上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)后，上機(jī)待測(cè)。

1.3.4 色譜條件

色譜柱DIKMA Diamonsil Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)相A為乙腈，B為磷酸水溶液（pH 3）。梯度洗脫程序?yàn)椋?~20 min，12%~30% A；20~32 min，30% A；32~36 min，30%~80% A；36~37 min，80%~12% A；37~45 min，12% A。

1.3.5 定性、定量檢測(cè)

1.3.5.1 定性檢測(cè)

取1.3.2中10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和按1.3.3處理所得樣品溶液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，根據(jù)6種異黃酮各組分在色譜柱中的行為差異，體現(xiàn)在色譜圖中為不同保留時(shí)間，以此定性。

1.3.5.2 定量檢測(cè)

將不同濃度的6種異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)檢測(cè)，縱坐標(biāo)為各異黃酮的色譜峰面積，橫坐標(biāo)為各異黃酮的具體濃度，繪制曲線，曲線濃度盡可能覆蓋樣品中各組分的濃度，如果樣品濃度超出曲線范圍，則將樣品溶液適當(dāng)稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的優(yōu)化

分別用甲醇溶液、80%甲醇溶液、乙腈溶液、80%乙腈溶液、二甲亞砜溶液、50%二甲亞砜溶液提取，結(jié)果表明，采用80%甲醇溶液的提取率最高，提取效果最好。

2.1.2 提取方式的優(yōu)化

比較振蕩、超聲、磁力攪拌等3種提取方式的提取效果。由于豆芽粉碎后會(huì)聚在一起，磁力攪拌效果并不好；振蕩對(duì)于離心管的要求比較高，稍不留意溶液就會(huì)灑到離心管外壁上，影響提取的效率，超聲提取可以避免另外2種提取方式帶來(lái)的弊端，因次選用超聲20 min的提取方式。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

6種異黃酮極性不同，故采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離，為得到更好的分離效果，采用不同的流動(dòng)相進(jìn)行分離。試驗(yàn)用乙腈-水、甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)，大豆苷和大豆黃苷不能完全分離；用色譜甲醇和含0.1%甲酸的水溶液作流動(dòng)相時(shí)，大豆黃素和大豆素分離效果不理想；采用磷酸水和乙腈，通過(guò)優(yōu)化磷酸的pH和比例，使6種標(biāo)樣混標(biāo)得到很好分離，詳見(jiàn)圖1。豆芽發(fā)芽過(guò)程中提取液也可得到有效分離，詳見(jiàn)圖2。

圖1 6種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 發(fā)芽96 h豆芽中6種大豆異黃酮色譜圖

2.3 方法的線性關(guān)系與檢出限、定量限

將分別配制的1，2，5，8，10和20 μg/mL 6種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以S/N=3確定方法的檢出限，S/N=10確定方法的定量限。6種異黃酮類的標(biāo)曲和檢出限和定量限如表1所示。

表1 6種異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與檢出限

2.4 方法的回收率和精密度

由于豆芽中6種異黃酮組分含量差異較大，且均在1~100 mg/kg，試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品為6種異黃酮的混合標(biāo)準(zhǔn)品，故在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，分別對(duì)樣品加入1倍、6倍和10倍定量限濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行測(cè)定，平均回收率在90%~110%，SRSD在5%以內(nèi)，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求，可以滿足檢測(cè)需求。

表2 6種異黃酮類的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 豆芽中6種異黃酮類成分的變化

由圖3可以看出：大豆在整個(gè)發(fā)芽過(guò)程中含量均有變化，大豆異黃酮的總量先增加后減少，且總量在發(fā)芽后48 h達(dá)到最大；其中大豆素、大豆黃素、染料木素的含量不斷增加；不論在哪個(gè)階段，大豆苷和染料木苷的含量之和占所有異黃酮種類之和的比重均在60%以上，因此，豆芽中的大豆異黃酮主要為大豆苷和染料木苷。

圖3 大豆發(fā)芽過(guò)程中6種異黃酮含量變化

發(fā)芽過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，72和96 h的豆芽出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象。從浸泡后到發(fā)芽48 h，也就是出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象前，6種異黃酮均不同程度增長(zhǎng)，大豆苷增加60.0%，其中染料木苷增加63.3%。出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象后，大豆苷、大豆黃苷、染料木苷的含量均有所降低，其中染料木苷含量降低50.7%，大豆黃苷含量降低49.6%，大豆苷含量降低9.97%。所以說(shuō)纖維化是影響豆芽中異黃酮類物質(zhì)含量的一個(gè)原因，在泡發(fā)豆芽時(shí)，要注意觀察，不要泡發(fā)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，以免豆芽出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象。

分析原因，纖維化發(fā)生前，所有異黃酮類物質(zhì)含量均有所增加，可能原因是大豆在發(fā)芽過(guò)程中，其呼吸作用逐漸增強(qiáng)，其內(nèi)溶物發(fā)生一系列生化反應(yīng)，酶的種類和數(shù)量增加，如苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）[15-17]，此酶是生物合成大豆異黃酮代謝的重要酶，該酶激活大豆異黃酮的合成體系和轉(zhuǎn)化體系。大豆體內(nèi)的內(nèi)源性糖苷酶也可能發(fā)揮作用，使大豆異黃酮糖苷和苷元間發(fā)生轉(zhuǎn)化[18-19]，從而使得異黃酮類物質(zhì)量不斷增加。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立大豆制品中的大豆苷、大豆素、大豆黃苷、大豆黃素、染料木苷、染料木素等6種異黃酮類的HPLC-DAD檢測(cè)方法。結(jié)果表明，6種物質(zhì)線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收結(jié)果符合要求，靈敏度高，前處理操作簡(jiǎn)便，可用于在實(shí)際檢測(cè)工作。

豆芽中大豆異黃酮的主要種類為大豆苷和染料木苷，兩者的含量之和占所測(cè)大豆異黃酮含量的60%以上；經(jīng)過(guò)發(fā)芽可以提高豆芽中大豆異黃酮含量，但要防止豆芽纖維化，纖維化會(huì)使大豆苷、大豆黃苷、染料木苷的含量降低。