四川內江兩種野生天冬品質及去皮前后活性成分分析

勾鳳杰，李博

中國農業大學食品科學與營養工程學院（北京 100083）

天冬（Radix asparagi）是百合科植物天門冬[Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.]的干燥塊根，是一種傳統中藥，具有養陰潤燥、清肺生津的功效，主要用于肺燥干咳、頓咳痰黏、咽干口渴、腸燥便秘等癥狀[1]。隨著中藥研究的深入，人們發現天冬中含有多糖類、皂苷類、氨基酸等多種活性成分[2]，具有抗癌[3-4]、抗衰老[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、調節腸道菌群[10]、神經保護[11-12]等多種藥理功效，但天冬中的活性成分含量因產地和品種的不同具有較大的差異[13-16]，因此目前對于天冬藥材質量尚未有統一的評價標準。

四川省內江市是天冬的主產地之一，該地種植天冬的歷史悠久，規模龐大，有“中國天冬之鄉”的美譽[17]。除了大片天冬種植園外，研究人員還發現該地存在一些野生天冬，這些野生天冬生長環境偏僻，不易查尋。此研究是以此地發現的兩種野生天冬為試驗材料，測定其水分、灰分、淀粉、蛋白質等基礎成分和多糖、皂苷、游離氨基酸等活性成分指標，從而篩選出更為優良的野生天冬品種，為其是否適合進行大規模人工栽培提供理論依據。此外，天冬藥材在炮制過程中往往有“去皮”這一步驟[18]，而有研究表明天冬皮中也含有較多的活性成分，這樣做會降低天冬的利用價值[14]，因此，此研究還測定了去皮前、后天冬中總多糖、總皂苷、游離氨基酸等活性成分的含量，探究去皮的操作是否會顯著改變天冬中活性成分的含量，旨在為今后天冬藥材的制作方法提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生鮮天冬（四川省內江市山區），于傳統收獲季節采挖并經由中國農業大學食品科學與營養工程學院李博教授鑒定。

C10J9Q52616標準品薯蕷皂苷元（上海源葉生物科技有限公司）；SLCJ4452氨基酸混合標準液[西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]；C10421163D-無水葡萄糖（上海麥克林生化科技股份有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司）；蒽酮、香蘭素、福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；濃硫酸、高氯酸、正丁醇、鹽酸（分析純，北京化工廠）；無水碳酸鈉（西隴化工股份有限公司）；石油醚[現代東方（北京）科技發展公司]。

1.2 儀器與設備

DTM-4T高溫馬弗爐（上海儒一恒溫設備中心）；DHG-9023A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；UV-5100紫外分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）；KDN-04A自動凱氏定氮儀[閩測儀器設備（廈門）有限公司]；LC-15C高效液相色譜系統[島津國際貿易（上海）有限公司]；MS204S電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理及形態特征比較

將采集到的新鮮天冬用冰袋運至實驗室，待洗凈晾干后進行長度、直徑、重量的測定。之后對樣品進行切片、烘干、制成粉末和過篩，備用。

1.3.2 水分、灰分、淀粉、蛋白質的測定

水分測定按照GB 5009.3—2016[19]《食品中水分的測定》中的第一法；灰分測定依據GB 5009.4—2016[20]《食品中灰分的測定》中的第一法；淀粉的含量按照GB 5009.9—2016[21]《食品中淀粉的測定》中的第一法進行測定；蛋白質的含量按照GB 5009.5—2016[22]《食品中蛋白質的測定》中的第一法測定。

1.3.3 天冬總多糖的測定[16]

繪制標準曲線：精密稱取10 mgD-無水葡萄糖標準品，加水溶解，隨后轉移至25 mL容量瓶中定容，搖勻，即為對照品溶液。分別精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL無水葡萄糖標準溶液置于具塞試管中，加水至2 mL，緩慢滴加8 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，混勻，置沸水浴中水浴10 min，取出，置冰水浴中冷卻10 min，空白對照為水。采用紫外-可見分光光度法在576 nm處測定溶液吸光度，以吸光度為縱坐標，無水葡萄糖質量為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程，如圖1所示。

圖1 D-無水葡萄糖標準曲線

樣品溶液制備：精密稱取1 g天冬粗粉（過0.425 mm篩），置200 mL具塞錐形瓶中，加100 mL石油醚，回流提取至提取液無色，藥渣揮干溶劑；再加入100 mL體積分數為80%的乙醇，水浴回流1 h，趁熱過濾，將殘渣及濾紙置錐形瓶中，加80 mL水，于100 ℃水浴回流1.5 h，趁熱濾過，殘渣及錐形瓶用熱水10 mL洗滌1次，濾液加水定容至100 mL容量瓶中。精密量取0.5 mL待測樣，加水至2 mL，按標準曲線繪制項中的方法顯色和測定，以對照品計算各樣品中天冬總多糖的含量。

1.3.4 天冬總皂苷的測定[16]

總皂苷標準曲線繪制：精密稱取5 mg薯蕷皂苷元對照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻即得。分別精密吸取0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mL對照品溶液于具塞試管中，置水浴中揮干甲醇液體，之后分別加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，蓋上試管塞混勻，在60 ℃水浴加熱顯色15 min，結束之后冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻。空白對照為甲醇，用相同方式顯色，采用紫外-可見分光光度法在456 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，薯蕷皂苷元質量為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程，如圖2所示。

圖2 薯蕷皂苷元標準曲線

樣品溶液制備：精密稱取1 g天冬粗粉（過0.425 mm篩），置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密吸取50 mL 48%乙醇，搖勻，超聲61 min，過濾后取25 mL續濾液，沸水浴蒸干，加水轉移至10 mL容量瓶中并定容，用水飽和正丁醇（每次約10 mL）萃取3次，萃取液合并后減壓回收至干，殘渣加甲醇轉移至25 mL容量瓶中并定容，作為樣品溶液。精密吸取一定量的樣品溶液，按標準曲線繪制項下的方法顯色和測定，以對照品計算各樣品中天冬總皂苷的含量。

1.3.5 天冬游離氨基酸的測定[23]

采用HPLC-異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法測定，包括樣品處理、柱前衍生、液相分析及含量計算四部分。

樣品處理：參考劉夢迪[16]試驗方法，并加以修改。精密稱取1 g（精確至0.001 g）大天冬粗粉，置250 mL具塞錐形瓶中，加入80 mL水，在90 ℃水浴80 min，趁熱濾過，殘渣及錐形瓶用10 mL熱水洗滌后，收集濾液，加水定容至100 mL，搖勻，即得樣品溶液。

柱前衍生：衍生前先將樣品溶液用水系濾膜過濾（去除水系雜質），之后將100 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯、100 μL 1 mol/L三乙胺與200 μL樣品混合于離心管中，漩渦振蕩均勻，室溫黑暗條件下1 h，結束后，向上述反應體系中加入400 μL正己烷，漩渦振蕩1 min，靜置10 min，用移液槍吸取下層溶液，并用0.22 μm有機濾膜過濾，濾液進行HPLC分析。

HPLC分析：流動相A：10 mmol/L磷酸氫二鈉，10 mmol/L硼酸鈉，用鹽酸調節pH至8.2；流動相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）。采用島津LC-15C，Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm），流速0.7 mL/min，室溫，檢測波長254 nm，進樣量0.7 μL。

氨基酸含量計算：以0.1 mol/L鹽酸稀釋的氨基酸為標準品，制備一系列濃度的氨基酸標液（0.125，0.25，0.5，1和2 μmol/mL），得到各氨基酸峰面積相對于其濃度的標準曲線方程，以計算氨基酸含量。氨基酸混合標準品色譜圖如圖3所示。

圖3 氨基酸混合標準品色譜圖

1.4 數據處理

所有試驗均設重復、平行各3次，所得數據采用Microsoft Excel 2016和 SPSS 27.0軟件進行數據統計分析，采用Graphpad Prism 8進行標準曲線和氨基酸色譜圖的繪制。根據計算得到的數據對兩種天冬進行對比，并結合其他文獻資料進行綜合評價。

2 結果與分析

2.1 兩種野生天冬形態特征比較

此試驗樣品是來自四川內江山區的兩種野生鮮天冬，如圖4所示。兩種天冬均呈長紡錘形，其中大天冬（a）彎曲程度較為明顯，而小天冬（b）略有彎曲。大天冬外皮多呈淡黃棕色，半透明；小天冬外皮顏色偏深，且表皮帶有深淺不等的縱皺紋。大天冬質地稍軟，而小天冬質地較為堅硬；兩種天冬斷面都有黏性，且中部有不透明的細心，呈黃白色，以上特點均符合天冬特征。如表1所示，大天冬長8~14 cm，直徑約為2.2~3 cm，平均質量在60 g左右；小天冬長5~7 cm，直徑約為1~2 cm，平均重量為10 g左右。綜上可知，大天冬塊長約為小天冬2倍，鮮體質量約為小天冬的6倍，表明大天冬個頭更大。張先等[24]測定的貴州產地野生鮮天冬的鮮重為63.31 g，與此研究結果相近，但其直徑比大天冬要小。

圖4 大天冬（a）與小天冬（b）

表1 兩種鮮天冬性狀特征比較

2.2 兩種野生天冬的基本成分和藥理活性成分分析

兩種野生天冬的基本成分含量如表2所示。兩種天冬的水分含量均在70%以上，且小天冬的水分含量高于大天冬，二者具有一定的顯著性差異（P＜ 0.05）。兩種天冬的灰分含量為2.18~2.59 g/100 g，均低于熊大勝等[25]測定的廣西、湖南、云南等產地天冬的灰分含量3.01~3.17 g/100 g。大天冬中的淀粉含量較高，為29.69 g/100 g，其含量約為小天冬3倍，說明兩個品種的淀粉含量差異較大。大天冬、小天冬中的蛋白質含量不存在顯著性差異。

據報道，天冬中主要含有多糖、皂苷和游離氨基酸等藥理活性成分[26]，其中多糖有抗癌[27-28]、增強機體免疫活性[29]等功能。皂苷有抗腫瘤[30]、抗炎[31]、治療便秘[32]等作用。氨基酸有鎮咳平喘[33]、降血壓和降血糖[34]等功效，因此分析兩種野生天冬中的藥理活性成分含量十分重要。如表2所示，大天冬的總多糖含量為16.17 g/100 g，總皂苷含量為3.63 g/100 g，游離氨基酸含量為1.98 g/100 g，其中多糖含量約為小天冬的2倍，皂苷含量高于小天冬，游離氨基酸低于小天冬，且均具有顯著性差異（P＜0.05）。熊大勝等[25]測定了重慶、云南、廣西和貴州等不同產地的天冬藥材中總多糖、總皂苷及總氨基酸的含量，結果發現多糖含量在9.53~13.46 g/100 g，皂苷含量在1.56~1.77 g/100 g，總氨基酸含量在4.13~9.99 g/100 g范圍內，經對比發現，此試驗樣品野生大天冬含有的多糖和皂苷要顯著高于重慶、云南、廣西和貴州等地的品種，但游離氨基酸含量要低于其測定的經酸水解后氨基酸的總含量。由此可見，野生大天冬具有更高的藥用價值。

表2 兩種天冬的營養成分分析

2.3 大天冬去皮前后藥理活性成分分析

在藥材炮制過程中，天冬要先進行去皮處理，但去皮可能會導致活性成分的損失[14]。因此，試驗對去皮前、后大天冬中的總多糖、總皂苷的含量及游離氨基酸種類和含量進行了分析。如表3所示，去皮之后大天冬中總多糖、總皂苷及游離氨基酸的含量均出現不同程度的顯著下降，其中總多糖含量下降近22%，總皂苷降低約32.5%，游離氨基酸總量下降約15.6%，且去皮前后的總多糖和總皂苷含量之間存在顯著性差異（P＜0.05）。李敏等[14]對產自四川內江種植區天冬藥材的表皮進行了多糖和皂苷的成分測定，發現一年半生天冬藥材的表皮中皂苷含量約為天冬藥材的2倍，同時也含有較高的多糖，這表明天冬皮含有較多的活性成分，與此試驗的結果具有一致性。

表3 大天冬去皮前后活性成分比較 單位：g/100 g

目前，研究者還尚未探究去皮對天冬中游離氨基酸組成的影響。因此，研究還測定了去皮前、后大天冬中游離氨基酸的種類和含量。如表4所示，去皮前后大天冬所含游離氨基酸種類是一致的，且大多數氨基酸的含量均出現了不同程度的下降。但去皮前，大天冬中甘氨酸最多，占總氨基酸的24.7%；甲硫氨酸最少，占總氨基酸的0.9%。去皮之后，蘇氨酸最多，占比25.5%；纈氨酸最少，占比0.7%，這表明去皮導致主要氨基酸的含量發生了變化。綜上可知，天冬表皮中也含有較多的多糖、皂苷和游離氨基酸，因此去皮之后會導致這些活性成分的損失，降低其藥用活性。

表4 大天冬去皮前后游離氨基酸種類 單位：mg/g

3 結論

此試驗對四川省內江市山區發現的兩種野生天冬進行了活性成分的檢測和品質分析。其中野生大天冬長約8~14 cm，直徑約為2.2~3 cm，平均質量為60 g。多糖、皂苷和游離氨基酸等藥理活性成分含量顯著高于小天冬，且優于其他產地天冬藥材的相關測定結果。野生大天冬在大小形態和藥理活性成分含量等方面均優于其他產地的現有天冬，因此適合進行大規模的人工栽培。此外，此研究還表明去皮會導致天冬總多糖、總皂苷及游離氨基酸等藥理活性成分的損失，因此，在天冬炮制過程中可以考慮省略“去皮”這一步驟，從而最大程度地保留天冬的藥理活性成分，同時也可減少人工成本和藥材資源的浪費。