長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性測(cè)定

牛生洋，劉強(qiáng)，李波，童艷梅，陳秀荔，趙永貞

1. 河南科技學(xué)院食品（新鄉(xiāng) 453003）；2. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧 530021）

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）又名“海葡萄”，是廣泛分布于熱帶、亞熱帶海域的一種暖溫性大型經(jīng)濟(jì)綠藻[1]。其富含多糖、多酚類、氨基酸、不飽和脂肪酸、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，且比普通藻類、蔬菜類所含營(yíng)養(yǎng)成分總量和種類都更高[2-3]。有人稱長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在食用時(shí)口感如魚子醬一般豐富，因此又有“綠色魚子醬”之稱[4-6]，常蘸醬調(diào)味生食、搭配海鮮涼拌，或制成高級(jí)料理。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻由于其安全性高，目前已經(jīng)成為保健食品、藥物及化妝品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在保健品市場(chǎng)擁有廣闊的開發(fā)前景[7-8]。

研究表明，海藻中生物活性物質(zhì)主要是海藻多酚，其是一類廣泛存在于藻類體內(nèi)的間苯三酚衍生物，可保護(hù)海藻自身免受植食性動(dòng)物干擾，具有多種生物學(xué)活性[9]，尤其是抗氧化活性[10-11]。有報(bào)道指出，海藻能暴露于產(chǎn)生自由基和氧化劑環(huán)境中生長(zhǎng)，就是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)，如來(lái)自加拿大的掌狀紅皮藻[12]、馬來(lái)西亞的總狀蕨藻和匍枝馬尾藻，以及法國(guó)的雙歧藻和歐囊鏈藻[13]。然而，關(guān)于長(zhǎng)莖葡萄蕨藻是否具有相同的生物活性物質(zhì)卻鮮有報(bào)道。

近年來(lái)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在我國(guó)近海漁區(qū)繁殖迅速，如果不加限制，將嚴(yán)重影響我國(guó)漁業(yè)生產(chǎn)。此次研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚常規(guī)提取工藝，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，以期為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻采于廣西省防城港市國(guó)家級(jí)廣西SPF南美白對(duì)蝦良種場(chǎng)；ABTS標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸標(biāo)品、茶多酚標(biāo)品、水楊酸（北京索萊寶科技有限公司）；過(guò)硫酸鉀、福林-酚試劑（上海麥克林生化有限公司）；無(wú)水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水碳酸鈉（天津市紅巖化學(xué)試劑廠）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）（上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；硫酸亞鐵（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；30%過(guò)氧化氫（成都金山化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AR1140分析天平（深圳市時(shí)代之峰科技有限公司）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；G9800A酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermol公司）；多功能粉碎機(jī)JR-200（永康市松青五金廠）；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

將長(zhǎng)莖葡萄蕨藻洗凈，于55 ℃烘干粉碎，過(guò)0.425 mm篩，置于干燥皿中備用。

1.3.2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取

稱取1 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末，在一定的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴溫度和水浴時(shí)間下進(jìn)行長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取，在5 500 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濾液用乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL于10 mL的試管中，加入0.5 mL的福林-酚顯色，5 min后加入2 mL的7.5 g/L的碳酸鈉溶液，用水定容至10 mL搖勻后在暗處反應(yīng)1 h，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.115 59X+0.121 7，R2=0.999 7。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率

用1 mL長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚代替沒(méi)食子酸，余下步驟同上；通過(guò)回歸方程，可得長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚質(zhì)量濃度，通過(guò)式（1）可得長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率。

式中：W為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率，mg/g；C為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為多酚體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；w為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

選取了溶劑種類、溶劑濃度、水浴時(shí)間、水浴溫度、水浴次數(shù)、料液比6個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)6個(gè)因素對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響程度，最終以溶劑濃度、料液比、水浴時(shí)間和水浴溫度四個(gè)因素做單因素試驗(yàn)[15-16]。

1.3.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間60 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%和80%對(duì)多酚提取率的影響。

1.3.5.2 料液比對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間60 min，考察料液比1∶30，1∶35，1∶40，1∶45和1∶50 g/mL對(duì)多酚提取率的影響。

1.3.5.3 水浴時(shí)間對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、水浴溫度70 ℃，考察水浴時(shí)間30，40，50，60和70 min對(duì)多酚提取率的影響。

1.3.5.4 水浴溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

取5份1 g長(zhǎng)莖葡萄蕨藻粉末，固定料液比1∶40 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、水浴時(shí)間60 min，考察水浴溫度60，65，70，75和80 ℃對(duì)多酚提取率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴時(shí)間和水浴溫度為自變量，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率為響應(yīng)值，對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.3.7 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚粗提物抗氧化性能測(cè)定

1.3.7.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

在試管中加入2 mL新鮮配制的0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，然后加入1.5 mL不同濃度梯度的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取液，混勻后暗室反應(yīng)0.5 h，在517 nm處測(cè)其吸光度A1；溶劑水代替樣品的吸光度為A3；用無(wú)水乙醇替代DPPH·乙醇溶液測(cè)吸光度A2，重復(fù)3次。以茶多酚作為陽(yáng)性對(duì)照，按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率[17-18]。

1.3.7.2 清除羥自由基能力的測(cè)定

參照范三紅等[19]的方法：首先配制9 mmol/L的水楊酸、9 mmol/L的FeSO4和8.8 mmol/L的H2O2。在試管中加入2 mL的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚，再加入水楊酸和FeSO4各1 mL，最后加2 mL的H2O2混勻，于37 ℃水浴0.5 h，在510 nm處測(cè)吸光度A1；用同體積的水代替長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚，測(cè)其吸光度A2；用同體積的水代替H2O2，測(cè)其吸光度A3。以茶多酚作為陽(yáng)性對(duì)照，按式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

1.3.7.3 清除ABTS自由基能力的測(cè)定

參照Cristina等[20]的方法：首先配制ABTS儲(chǔ)備液、7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，等體積混合避光室溫放置15 h，然后在734 nm下用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將ABTS儲(chǔ)備液的吸光度調(diào)為0.70左右，記為A1。將0.20 mL不同濃度的樣品溶液與2 mL的ABTS稀釋液混合于室溫反應(yīng)6 min后測(cè)定734 nm處的吸光度A2。按式（4）計(jì)算ABTS自由基清除率。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS（9.1）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.6（USA）作圖。最后用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，最大值為0.548 2 mg/g。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%后，由于極性作用會(huì)導(dǎo)致多酚與乙醇間的相互作用力減弱，進(jìn)而使多酚提取率減小，再者，高濃度溶劑也增加了工業(yè)生產(chǎn)的成本，因此選取60%為乙醇提取體積分?jǐn)?shù)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比中液體占比的升高，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后趨于穩(wěn)定，在料液比1∶40 g/mL時(shí)多酚提取率達(dá)到最大值0.482 2 mg/g，之后差異不大，在節(jié)約成本的原則上，料液比選擇1∶40 g/mL。

圖3 料液比對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，在提取溫度70 ℃時(shí)達(dá)到最大值0.513 2 mg/g，之后多酚的提取率開始下降。水浴溫度超過(guò)70 ℃，會(huì)使一部分不耐高溫的多酚分解，反而降低了提取率。因此選擇70 ℃的水浴溫度為提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.1.4 水浴時(shí)間對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

由圖5可知，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率先升高后降低，在水浴時(shí)間50 min時(shí)多酚提取率達(dá)到最大值0.536 8 mg/g，之后隨著水浴時(shí)間的增加，多酚的提取率開始下降。隨著水浴時(shí)間增加，提取出來(lái)的多酚開始氧化，導(dǎo)致多酚提取率下降。因此選擇50 min水浴時(shí)間為提取時(shí)間。

圖5 水浴時(shí)間對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴時(shí)間和水浴溫度為自變量，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率為響應(yīng)值，對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

Y=0.62+0.055A+0.003 133B+0.004 108C+0.002 042D+ 0.004 15AB-0.000 875AC+0.001 875AD-0.001 025BC-0.000 375BD+0.000 375CD-0.13A2-0.14B2-0.15C2-0.15D2

2.2.2 方差分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表3：模型P＜0.000 1，說(shuō)明模型差異高度顯著，方程的失擬誤差（P=0.256 7＞0.05）不顯著，表明該回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合較好，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型的方差分析

在試驗(yàn)中，一次項(xiàng)A對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），C達(dá)到顯著水平（P＜0.05），B和D為不顯著。交互項(xiàng)均為不顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均為極顯著，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)顯著性P值的大小可得到各因素對(duì)多酚提取率影響的順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞水浴溫度（C）＞料液比（B）＞水浴時(shí)間（D）。

2.2.3 響應(yīng)面法模型分析

響應(yīng)面的陡峭程度和等高線的稀疏可以反映兩個(gè)變量之間相互作用程度，響應(yīng)面越陡峭，等高線越密，說(shuō)明二者之間的相互作用越好[13,15]。由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比（圖6A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)與水浴時(shí)間（圖6B）及料液比與水浴溫度（圖6C）的響應(yīng)面曲線陡峭等高線明顯，說(shuō)明它們對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻總多酚含量的交互效應(yīng)顯著。

圖6 多酚提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖

2.2.4 最佳工藝預(yù)測(cè)及結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)Desige-Expert 8.0.6軟件分析得到長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚提取的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間50 min，重復(fù)3次驗(yàn)證該結(jié)果，得出長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率為0.632 9±0.021 mg/g，與預(yù)測(cè)值0.641 3 mg/g接近，說(shuō)明該模型擬合程度較好。

2.3 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚粗提物的抗氧化性

2.3.1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚粗提物清除DPPH自由基能力

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚對(duì)DPPH自由基清除能力的結(jié)果如圖7所示。隨著濃度的增加，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果也增加，在質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到52.81%，茶多酚在質(zhì)量濃度120 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到91.82%。茶多酚具有活潑的羥基氫，會(huì)與DPPH自由基結(jié)合，而長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚里的羥基氫較少，所以在相同濃度下茶多酚清除DPPH自由基的能力更強(qiáng)。

圖7 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除DPPH自由基的性能

2.3.2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚粗提物清除羥自由基

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚對(duì)羥自由基清除能力的結(jié)果如圖8所示。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚在低濃度時(shí)就表現(xiàn)出比較強(qiáng)的清除羥自由基的能力。在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除率就達(dá)到76.91%，茶多酚為47.21%；在質(zhì)量濃度120 μg/mL時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除率為92.26%，茶多酚為85.72%，說(shuō)明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚具有良好的清除羥自由基的能力。

圖8 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除羥自由基的性能

2.3.3 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚粗提物清除ABTS自由基

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚對(duì)ABTS自由基清除能力的結(jié)果如圖9所示。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚在低濃度時(shí)就表現(xiàn)出比較強(qiáng)的清除ABTS自由基的能力。在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除率就達(dá)到68.56%，茶多酚為22.34%；在質(zhì)量濃度120 μg/mL時(shí)，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除率為98.04%，茶多酚為89.51%，說(shuō)明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚具有良好的清除ABTS自由基的能力。

圖9 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚清除ABTS自由基的性能

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取工藝，最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間50 min，在此條件下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚的提取率為0.632 9±0.021 mg/g。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚對(duì)DPPH自由基的清除率低于茶多酚，對(duì)羥自由基和ABTS自由基的清除率明顯高于茶多酚；在低濃度（20 μg/mL）下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚對(duì)羥基自由基和ABTS自由基清除率分別為76.91%和68.56%，均高于茶多酚的47.21%和22.34%，說(shuō)明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻多酚具有良好的抗氧化性，為以后分析其生物活性奠定了基礎(chǔ)。