細胞凋亡在肝纖維化發生、發展中的作用研究進展

牛麗娜 竇婧 李棟棟 劉云霄 王曉忠

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是由多種原因包括炎癥反應、持續性病毒感染、酒精性或藥物毒性等引起的慢性肝損害所致的病理改變,是肝內細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積的結果[1]。若肝纖維化發生后得不到及時治療,可導致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。據統計,全球每年超過100萬人死于肝纖維化導致的終末期肝病,該病嚴重威脅著人們的身體健康[2]。細胞死亡是生物學中的一種普遍生命現象,在肝纖維化的發生、發展中起著重要作用。凋亡是細胞死亡的一種方式,本文主要綜述肝臟內各種細胞凋亡在肝纖維化發生、發展中的作用[6]。

一、細胞凋亡的途徑

1972年,Kerr、Wyllie和Currie首次提出了凋亡(apoptosis)一詞,它的形態學特征即細胞收縮、細胞膜發泡脫落、核染色質固縮進而碎裂,最終凋亡細胞分解成膜結合凋亡小體[3]。這一形態上的變化是一個協調的、通常是能量依賴性的過程,涉及一組半胱天冬酶的激活,以及將起始刺激與細胞最終死亡聯系起來的復雜級聯事件。低氧、輻射、熱和細胞毒性等刺激均可誘導細胞凋亡[2,3]。迄今為止的研究表明,在肝損傷中有兩種主要的細胞凋亡途徑:外源性途徑(死亡受體途徑)和內源性途徑(線粒體途徑)。

(一)細胞凋亡的外源性途徑(死亡受體途徑) 細胞凋亡的外源性基礎是死亡受體參與的信號轉導。Fas受體-配體途徑介導的細胞凋亡是迄今為止研究最為清晰的一種途徑。Fas在肝臟各種細胞中表達,其配體FasL以膜結合形式在體內存在。FasL與細胞表面的Fas結合后,啟動FasL的寡聚化和基于Fas的胞內死亡域與Fas相關死亡結構域(FADD)相互作用的基礎上進行信號轉導[3,4]。傳遞凋亡信號的FADD負責招募procaspase-8,形成Fas-FasL-FADD-procaspase-8死亡誘導信號復合物,該復合物導致procaspase-8裂解為有催化活性的形式并且激活下游效應因子caspase-3和caspase-7,從而引起細胞發生凋亡[2]。

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)及其受體介導的細胞凋亡:TRAIL的受體為死亡受體4(DR4)與死亡受體5(DR5)[5,6]。當TRAIL與DR4或DR5結合后導致DR4或DR5三聚化并組成死亡誘導信號復合物,繼而激活caspase-8,caspase-8直接激活caspase-3、caspase-6和caspase-7啟動細胞凋亡。

另一種死亡受體途徑為TNFR1信號轉導途徑介導的細胞凋亡[4-5]:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與其同源受體TNF-R1結合參與細胞凋亡信號的轉導。一般認為TNFR可與FADD結合,進而通過caspase-8途徑啟動細胞凋亡;TNFR也可以激活JNK[6],隨即JNK激活下游的促凋亡蛋白Bαx并且抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,進而誘導凋亡。

(二)細胞凋亡的內源性途徑(線粒體途徑) 線粒體是存在于大多數細胞中,為細胞的各種生命活動提供能量。在線粒體中含有一部分促凋亡蛋白,如促凋亡誘導因子AIF、核酸內切酶G、Smac/DIABLO、細胞色素c等[7-9]。當受到凋亡刺激因子作用時,如癌基因的活化DNA損傷、細胞缺氧[19]、細胞生長因子缺失、病毒等刺激激活位于細胞質中的Bαx,被激活的Bαx隨即移位到線粒體上[7,810],與位于線粒體外膜的Bak相結合,導致線粒體的通透性增強引起細胞色素c被釋放。細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和三磷酸腺苷(ATP)結合激活procaspase-9繼而活化caspase-3和caspase-7,誘發凋亡[11,12]。

二、細胞凋亡與肝纖維化

細胞凋亡由多種重要的凋亡調控因子如Bcl-2家族和抑癌基因p53參與調控。Bcl-2家族中的促凋亡蛋白包括BH123蛋白和BH3-only蛋白,其中BH123蛋白中的Bax和Bak以及BH3-only蛋白中的Bad、Bim、Puma等在細胞凋亡中死亡受體途徑與線粒體途徑均能激活caspase-3,誘導細胞凋亡。肝纖維化是慢性肝損傷的結果,涉及多種細胞與多個環節[13-15],可引起成纖維細胞、脂肪細胞、內皮細胞等產生膠原蛋白和細胞外基質(ECM)蛋白的異常沉積。近年來,多項研究表明,肝臟中各種細胞凋亡與肝纖維化密切相關。一般認為,肝星狀細胞(HSC)的活化是導致肝纖維化的主要原因。因此,誘導HSC凋亡和抑制HSC激活,是抗纖維化治療的重要手段。有研究已表明,通過(信號轉導與轉錄激活因子1)STAT1激活可直接誘導HSC凋亡,從而改善纖維化的進展[16,17]。除了HSC,肝臟膠原代謝的細胞學基礎還有肝細胞、巨噬細胞等,這些細胞分泌的基質金屬蛋白酶(MMP)及其抑制物(TIMP)[17]在肝纖維化的發生和發展過程中至關重要:MMP是可降解ECM的重要蛋白質分解酶,而TIMP是一組具有抑制MMP功能的活性多肽,從而抑制ECM的降解[28],引起肝纖維化。

三、肝臟內各種細胞凋亡與肝纖維化的關系

在肝臟穩態的情況下,細胞凋亡經過精確地調控,細胞發生凋亡的數量小,所以一般不會引發肝組織損傷。而在病理作用影響下,如急性肝炎表現出的凋亡超過了肝臟的再生能力或者慢性肝臟炎癥下顯現出的炎癥級聯反應的激活,最終將導致肝纖維化。肝細胞、肝星狀細胞凋亡對肝纖維化有重要影響。

(一)肝細胞凋亡對肝纖維化的影響 肝細胞約占肝臟細胞總量的80%,是肝臟中最主要的實質細胞。肝細胞凋亡可刺激基質沉積誘導肝纖維化[29]。在肝細胞凋亡的過程中,凋亡小體由細胞周期蛋白c(CCty-c)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、caspase-9和ATP/dATP形成,形成凋亡小體后,半胱天冬酶(caspase)被激活,導致caspase介導的級聯反應,最終發生肝細胞凋亡[18-19]。

肝細胞凋亡受Fas/FasL信號通路調控從而影響肝纖維化:Fas/FasL信號通路介導的細胞凋亡在肝纖維化的發生和發展中起重要作用。Fas與其配體FasL結合后觸發凋亡信號。在慢性乙型病毒性肝炎與慢性丙型病毒性肝炎患者中,有12%～65%的肝細胞發生凋亡與Fas/FasL途徑相關,通過激活Fas死亡受體,細胞凋亡可引發促纖維化反應。誘騙受體3(DcR3)是腫瘤壞死因子(TNF)家族的新成員,可與Fas 配體結合,通過 Fas/FasL 信號通路介導的細胞凋亡。金珍婧教授團隊[20]前期研究發現肝細胞經過DcR3處理后,Fas、FasL的表達被抑制進而減少了肝細胞的凋亡;該團隊通過進一步研究發現,使用DcR3可明顯抑制肝纖維化大鼠肝組織中Fas、FasL的mRNA和蛋白質表達水平;同時發現DcR3能與Fas競爭性結合配體FasL,導致 FasL與Fas結合降低,進而抑制了Fas/FasL信號通路誘導肝細胞凋亡。綜上研究結果表明,DcR3可緩解肝纖維化的作用機制之一。同時,Siwei Tan等發現Fas/FasL信號通路通過調節自噬信號和NF-κB p65磷酸化促進PUMA介導的肝細胞凋亡,而抑制自噬或PUMA缺乏則減弱Fas/FasL調節的肝細胞凋亡和肝纖維化[21]。

肝細胞凋亡受PI3K/Akt信號通路調控從而影響肝纖維化:PI3K是胞內的信號轉導分子,當受到外界刺激后被激活,活化的PI3K刺激Akt與膜結合,在磷脂酰肌醇依賴蛋白的作用下Akt被活化為p-Akt,隨后激活Bcl-2相關死亡啟動子、核因子κB( NF-κB)等下游相關靶蛋白從而調節細胞凋亡。劉偉教授團隊[22]揭示了PI3K-Akt抑制劑誘導死亡受體介導的肝細胞凋亡與肝損傷機制發現PI3K-Akt抑制劑促進了小鼠肝細胞凋亡,同時首次證明了PI3K-Akt抑制劑類藥物可以促進死亡受體介導的肝細胞凋亡。另外,Li Yang等[23]研究發現Tβ4和lincRNA-p21的表達均與肝纖維化密切相關,Tβ4可通過抑制PI3K-Akt-NF-κB通路來抑制lincRNA-p21過表達誘導的肝細胞凋亡和纖維化。

另外,參與肝細胞凋亡的的手段還有發現的一種減少肝損傷的方法:抑制刺激肝細胞凋亡的應激信號即屬于MAPK途徑的凋亡信號調節激酶(ASK1),它參與肝細胞凋亡、炎癥和纖維化。在該項研究中結果發現選擇ASK1抑制劑Selonsertib可改善了NASH小鼠模型導致的肝纖維化[24]。

(二)肝星狀細胞凋亡對肝纖維化的影響 在正常的肝組織中,肝星狀細胞約占肝實質細胞的5%,是維生素A的主要存儲部位。但是在慢性炎癥影響的情況下,肝星狀細胞促進細胞外基質(ECM)的沉積,導致肝纖維化[24]。凋亡在HSC的激活中起著十分重要的作用,影響著肝纖維化的進展[22]。HSC凋亡的中心特征是細胞核DNA的降解和修飾,發生凋亡的細胞中DNA和胞苷磷酸鳥苷(CpG)使HSC中的轉化生長因子-β1(TGF-β1)和膠原蛋白1(collagen-1)上調加重肝纖維化?；罨腍SC主要通過細胞凋亡途徑減少:HSC胞內的caspase可通過胞外的死亡信號激活導致HSC發生凋亡,也可經過線粒體膜通透性轉運孔(MPT)的開放導致HSC凋亡。

肝星狀細胞凋亡受Fas/FasL信號通路調控從而影響肝纖維化:早在1998年,Gong等就已經發現HSC的凋亡反應與可溶性FasL成劑量依賴關系,同時證明了HSC通過Fas受體途徑發生凋亡。因此,我們可利用該信號通路調控細胞凋亡逆轉肝纖維化。近年有研究結果表明:水飛薊賓可以增加Fas與caspase-8的表達,通過Fas/FasL信號通路誘導HSC發生凋亡[25]。我國名老中醫林沛湘所創用于治療肝纖維化的經驗方壯肝逐瘀煎,已經通過實驗驗證了該方可通過下調Fas、FasL來抑制HSC凋亡[26]。另一項研究也表明[29],HSC經索拉非尼干預后,Fas、FasL和caspase-3表達水平上調,并降低了Bcl-2與Bαx的比率,誘導了HSC凋亡。

肝星狀細胞凋亡受PI3K/Akt信號通路調控從而影響肝纖維化:PI3K/Akt信號通路在肝星狀細胞凋亡的調節過程中至關重要[27]。在一項研究中發現,X射線照射HSC后,激活PI3K/Akt通路可使HSC活化水平增高,同時凋亡率也有所升高;而抑制PI3K/Akt信號通路后,HSC活化水平降低,緩解了肝纖維化[28]。在肝纖維化過程中,PI3K/Akt信號通路常處于活化狀態。纖維化改善可以用藥物通過PI3K/Akt信號通路誘導HSC凋亡來治療,索拉非尼是一種多效激酶抑制劑,可以抑制人及大鼠肝臟中的HSC活性,促進HSC凋亡。Yan Wang等[29]發現索拉非尼無論在體外或者在體內都能夠抑制Akt的磷酸化,阻斷PI3K/Akt/p70S6K信號通路可誘導HSC凋亡并減輕肝纖維化。Qin Chen等[30]證明了雙氫青蒿素通過阻斷PI3K/AKT信號通路可誘導HSC凋亡,同時該團隊進行了PI3K特異性抑制劑LY294002模擬了雙氫青蒿素的促凋亡作用的過程,發現雙氫青蒿素是預防和治療肝纖維化突出,值得進一步深入探討。趙鐵建團隊[31]通過使用HSC-T6細胞探討黃醇對肝星狀細胞PI3 K/Akt/mTOR信號通路的影響,證明了姜黃酚通過抑制該途徑誘導HSC凋亡,從而達到抗肝纖維化的目的。

綜上,細胞凋亡是一個非常復雜的過程,是由基因控制的細胞自主的有序的死亡,具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制。肝臟中的肝細胞、肝星狀細胞等異常凋亡在肝纖維化的發生、發展過程中扮演著重要作用,故抑制或誘導肝臟中的細胞凋亡為抗肝纖維化提供了新的思路。目前研究最為透徹的是Fas/FasL信號通路以及PI3K/Akt信號通路誘導的細胞凋亡。盡管在抗纖維化的斗爭中細胞凋亡的研究取得了一定的進展,但是對細胞凋亡的調控以及分子機制仍有待進一步探討。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。