乙型肝炎病毒感染性疾病患者腸道菌群結構和多樣性分析

趙成燕 周欣怡 高冉冉 韓丹 鄭嶸炅 魯曉擘

乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA病毒科病毒,其感染成為全球性公共衛生問題。雖然隨著乙型肝炎疫苗的普及,我國在HBV感染防治方面已取得巨大成績,低年齡組人群HBV感染率大幅度下降,但HBV防治形式依然十分嚴峻。國內仍約有7000萬HBV慢性感染者[1]。HBV感染早期無明確診斷,或對感染者進行持續治療,則部分患者會在感染后10～15年出現肝硬化、肝功能衰竭、甚至肝細胞癌(HCC)等[2]。國內肝硬化和HCC中分別約有77%和84%為HBV感染所致[3]。探究影響HBV感染者肝損傷及惡化的危險因素,對預防HBV感染者肝硬化、肝衰竭、HCC發生具有重要意義。人體腸道中種類繁多的微生物被稱為“腸道菌群”。正常情況下,人體腸道菌群參與宿住新陳代謝,維持宿住身體健康?，F有研究證實,腸道菌群失調可能與慢性肝損傷[4]、糖尿病[5]、惡性腫瘤[6]等發生有關。趙志方等[7]研究發現,與健康人群相比,慢性乙型肝炎(CHB)患者體內出現普雷沃氏菌屬(Prevotella)、勞特氏菌屬(Blautia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、真桿菌屬(Eubacterium eligens group)等菌屬失調,單形擬桿菌中的Ruminococcus sp.5-1-39BFAA與丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、超敏C反應蛋白(HsCRP)、國際標準化比率(INR)水平呈顯著負相關,Bacteroides uniformis與ALT水平正相關,提示腸道菌群失調可能在肝損傷發生發展中發揮一定作用。但關于不同肝損傷程度的HBV感染者腸道菌群失調的具體表現,目前尚缺乏相關數據報道。本研究采用基因測序法對HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化(LC)、肝細胞癌(HCC)、慢加急性肝衰竭(ACLF)、自身免疫性肝炎(AIH)、原發性膽汁性肝硬化(PBC)患者腸道菌群進行測定分析,以明確腸道菌群失調在HBV感染肝臟功能損傷發生、發展中的作用機制,從而為HBV者持續干預提供參考。

資料與方法

一、一般資料

選擇2020年2月—9月在新疆醫科大學第一附屬醫院肝病?？平邮茉\治的133例肝病患者為研究對象,其中HBV攜帶者(HBV組) 23例、LC(LC組) 25例、HCC(HCC組) 38例、ACLF(ACLF組) 16例、AIH (AIH 組)13例、PBC(PBC組)18例。納入標準:①HBV組和LC組診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》有關標準[3],ACLF組符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》有關標準[8],HCC組符合《中國原發性肝細胞癌放射治療指南(2020年版)》中有關標準[9],AIH組符合《自身免疫性肝炎診斷和治療共識( 2015)》診斷標準[10],PBC組符合《對我國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》中診斷標準[11];②入組前3個月內未使用過抗菌類藥物,4周內未使用過益生菌或促胃腸動力藥物;③了解研究內容且簽署知情協議書。排除標準:①丙型肝炎病毒等其他肝炎病毒感染性疾病;②具有消化道器質性病變或手術操作史;③具有甲狀腺功能異?；蜃陨砻庖呦到y疾病;④無糖尿病、脂肪肝代謝性疾病[2]。6組患者基本資料間比較差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。本研究符合醫學倫理學標準。

表1 各研究樣本基本情況比較

二、研究方法

(一)樣本采集 留取納入者晨起時新鮮糞便樣本,采樣勺取其中間部分置入采樣管,-80 ℃冷藏待用。

(二)DNA提取及擴增 CTAB法(諾禾致源)提取糞便樣本中細菌總DNA,1%瓊脂凝膠電泳監測所提取總DNA濃度和完整性。無菌水將DNA樣本稀釋至1 ng/mL。利用特定性引物擴增DNA樣本中16S rRNA基因的V3～V4可變區域(PCR擴增條件:98 ℃初變性60 s,隨后98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃伸長30 s,共30個循環,之后72 ℃延伸5 min)。PCR擴增產物與相同體積1×負載緩沖液混合,2%瓊脂凝膠電泳儀電泳,Qiagen Gel Extraction對混合PCR產物進行純化。

(四) 生物信息分析 FLASH對剪切的reads進行合并;根據QIIME質量控制流程對原始標簽在特定過濾條件下進行質量過濾,得到高質量的潔凈標簽;UCHIME將標簽與參考數據庫進行比較,去除嵌合體序列;最終獲得有效標簽。Usparse軟件進行序列分析,相似度≥97%的序列被分配到相同的可操作分類單元(Operational taxonomic units,OTU)中;Silva數據庫基于Mothur算法對OTU進行分類信息標注;QIIME軟件(Version 1.7.0)計算樣本腸道菌群多樣性;QIIME軟件(Version 1.9.1)計算加權和未加權單株的Beta多樣性;R軟件(Version 2.15.3)中的ade4包和ggplot2包對原始變量主成分分析(Principal component analysis,PCA)和主坐標分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA);QIIME軟件(Version 1.9.1)進行非加權算術均值對組法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means,UPGMA)聚類。

三、統計學方法

結 果

一、各組患者腸道菌群組成

6組的138個樣品共獲得83 065條有效數據,經過質控得到69 984條數據,質控有效率為83.83%。按照97%的一致性,將獲得有效序列聚類成OTUs,共得到12 022個OTUs。不同組間特有和共有OUT花瓣圖分析繪制成韋恩圖,其中HBV組獨有OTUs數目最多,LC組次之,AIH組最少,見圖1。HBV組獨有OTUs數目最多,其次為LC組、PBC組、HCC組,AIH和ACLF組最少。

圖1 各組腸道微生物OUT分布韋恩圖

二、腸道菌群結構

物種注釋結果顯示,6組樣本門水平上最大豐度均處于前10位的分布為Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota、Actinobacteria、Verrucomicrobiota、Fusobacteriata、Cyanobacteria、Unidentified bacteria、Actinobacteriota、Synergistota,其中以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主,HBV組、LC組、HCC組、ACLF組、AIH組和PBC組樣本中最大豐度處于前4位菌門的總占比分布為88.76%、97.22%、96.15%、92.88%、95.91%和93.36%,見圖2。

圖2 各組門水平物種相對豐度柱狀圖

在門的水平上,HBV組和HCC組Actinobacteria豐度顯著高于LC組,HBV組Actinobacteriota豐度顯著高于LC組、HCC組和ACLF組,LC組和ACLF組均顯著低于PBC組;LC組Bacteroidota豐度顯著高于HCC組;HCC組的Firmicutes豐度顯著高于HBV組;同時,HBV組其他菌門豐度均顯著高于LC組、HCC組和ACLF組,ACLF組明顯低于PBC組,差異均具有統計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 各組門水平上物種顯著性差異統計圖

三、各組腸道菌清α多樣性比較

從每個樣本中抽取一定測序量的數據,統計其所代表物種數目,并以此構建稀釋曲線,結果顯示,隨測序量增加,各組觀測物種數量不斷增加,且最終均趨于平坦,測序數據量和深度均合理(圖4左)。Round-Abundance曲線分析顯示:HBV組橫軸上范圍最大,物種豐度最大,PBC組次之,隨后依次為LC組、HCC組、ACLF組,AIH組橫軸上范圍最小,物種豐度最低;縱軸上,HBV組曲線最平緩,物種分布最均勻,其次依次為PBC組、LC組和HCC組,ACLF組和AIH組平緩度相似,兩組均勻度相對較差(圖4右)。

圖4 各組樣本物種多樣性比較(左:稀釋曲線;右:Rank-Abundance曲線)

四、各組腸道菌群的β多樣性分析

PCA主成分和PCoA主坐標分析顯示,6組樣本腸道菌群存在明顯差異(圖A和B)?；讦露鄻有跃嚯x非度量多維尺度分析(NMDS)顯示,HBV組、LC組、HCC組和PBC組中樣本間離散度較高,組內菌群差異性較大,ACLF組AIH組中樣本間距較近,組內群落比較集中。HBV組與LC組、HCC組、PBC組樣本多分布于不同區域,組間腸道菌群群落結構差異較大;ACLF組與AIH組樣本間距較近,群落結構相似,見圖5。

圖5 各組腸道菌群多樣性的PCA(A)、PCoA(B)和NMDS分析(C)

五、各組樣本腸道菌群復雜度分析

HBV組所測物種數明顯多于LC組、HCC組和ACLF組,LC組明顯低于AIH組和PBC組,HCC組和ACLF組均顯著低于PBC組(P<0.05),而AIH組與HBV組、HCC組和ACLF組間所測物種數間比較差異均無統計學意義(P>0.05)(圖6左)。HBV組Shannon指數明顯高于LC組和ACLF組,LC組、HCC組、ACLF組Shannon指數均明顯低于PBC組(P<0.05),但HBV組與HCC組、AIH組與HBV組、HCC組和ACLF組Shannon指數間比較差異均無統計意義(P>0.05)(圖6右)。

圖6 各組腸道菌群復雜度比較

六、各組樣本菌群屬間差異分析

HBV組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Unidentified-Chloroplast,豐度最低的為Escherichia-Shigella、Ruminococcus、Pseudomonas、Veillonella;LC組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Megamonas、Clostridioides、Prevotella-9、Dialister,豐度最低的為Bifidobacterium、Streptococcus、Blautia、[Rumimococcus]-gnavus-group;ACLF組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Akkermansia、Anaeroglobus、Lactiplantibacillus,豐度最低的為Megaspaera、Ligilactobacillus;HCC組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Acinetobacter、Ralstonia、Subdologrenulum、Pseudomonas,豐度最低的為Prevotella-9、Parabacteroides;AIH組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Bacteroides、Blautia、[Rumimococcus]-gnavus-group,豐度最低的Enteroccocus;PBC組樣本中屬水平菌群含量最豐富的是Prevotella、Alloprevotella、Neisseria、Fusobacterium,豐度最低的Alistipes、Agathobacter,見圖7。

圖7 Heatmap圖比較差異菌種在各組中的分布

通過對6組樣本進行LEfSe分析(LDA閾值設定為4),共發現23個biomarker,其中ACLF組生物多樣性最豐富,代表菌群較多,LC組和PBC組次之,隨后依次為HBV組和AIH組;HCC組多樣性較少,且與其他菌群存在較大重疊,故無差異顯著的菌群,見圖8。

圖8 各組菌群屬間菌群LEfSe分析

討 論

HBV感染所致CHB可引起各種急、慢性肝損傷,進展為LC、ACLF或HCC等,嚴重損傷人類身心健康,威脅患者生命安全[12]。全球約有2.57億慢性HBV感染者,88.7萬死于CHB并發癥[13],38.4萬死于LC[14]。腸道菌群是人體最大且最重要的微生態系統,腸道中定植有超過100萬億個微生物,這些微生物參與并影響宿住生理代謝和各種生理病理過程[15-16]。肝病發病機制相關研究發現,慢性肝損傷患者體內會發生腸道菌群失衡,且腸道菌群失衡與HBV感染相關肝病發生、發展有關[17]。Wang等[18]利用Illumina MiSeq測序平臺對85例Child-Pugh評分較低的CHB患者腸道微生物組成與22例健康對照者進行比較發現,與健康人群相比,CHB患者腸道菌群發生明顯變化,表現為Actinomyces、Clostridium sensu stricto、unclassified Lachnospiraceae、Megamonas4個屬OTUs增加,Alistipes、Asaccharobacter、Bacteroides、Butyricimonas、Clostridium IV、Escherichia/Shigella、Parabacteroides、Ruminococcus、unclassified Bacteria、unclassified Clostridiales、Unclassified Coriobacteriaceae、Unclassified Enterobacteriaceae、Unclassified Lachnospiraceae和Unclassified Ruminococcaceae等27菌門減少,這些變化提示腸道菌群失衡與CHB進展具有潛在貢獻。

鄭婷婷等[19]研究顯示,健康人及CHB、LC和ACLF患者腸道菌群均以Firmicutes、Bacteroidota為主,與本研究結果略有不同,本研究以CHB、LC、HCC、ACLF 4個HBV感染不同階段患者和AIH、PBC患者腸道菌群結構為研究,6組樣本中門水平以Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota為主。這可能與研究對象生活于不同地區有關。李攀[20]研究結果顯示,腸道菌群與宿住信息存在廣泛聯系,地理因素對人體腸道菌群結構和多樣性的影響甚至超過了不同地區疾病的影響。邢樂康等[21]研究顯示,與健康人群相比,ACLF患者腸道菌群豐度和多樣性均下降,且隨著肝損傷病情進展腸道菌群失衡現象越嚴重。6組樣本腸道菌群豐度依次為HBV組、PBC組、LC組、HCC組、ACLF組、AIH組,HBV組、LC組、HCC組和PBC組組內菌群差異性較大,組間腸道菌群群落結構差異較大,ACLF組、AIH組中腸道菌群群落比較集中,群落結構相似。證實,HBV感染后隨肝臟損傷病情加重,其腸道菌群多樣性明顯下降,群落結構差異性增大,且相同肝損傷階段患者體內腸道菌群存在明顯個體差異。此外,HBV組和HCC組Actinobacteria豐度顯著高于LC組,HBV組Actinobacteriota顯著高于LC組、HCC組和ACLF組,LC組和ACLF組的Actinobacteriota及顯著低于PBC組;LC組Bacteroidota豐度顯著高于HCC組;HCC組的Firmicutes豐度顯著高于HBV組。Actinobacteria和Actinobacteriota下的雙歧桿菌科屬于腸道有益微生物,具有營養人體、增強機體免疫、改善胃腸功能等生理作用。Xu等[22]分析顯示,在CHB和LC患者體內腸道雙歧桿菌從有益菌轉變為機會病原菌,與健康人群相比,CHB和LC患者腸道中雙歧桿菌頻率減少,LC中檢出頻率低于CHB患者。Bacteroidota和Firmicutes均為腸道主要菌群,HBV感染導致機體腸道細菌多樣性下降,Bacteroidota下降,Firmicutes增多。Bacteroidota中含有膽汁酸鹽水解酶,其可直接與膽鹽和膽固醇等結合,從而降低機體膽固醇,故其下降可加重肝組織損傷,增加癌變風險[23]。Bacteroidota和Firmicutes相互作用下,腸道有效吸收食物中熱量、積累脂肪,脂肪的積累會減少腸道黏蛋白,降低腸道屏障能力,增加Firmicutes侵襲風險,增加機體炎癥反應,加重肝臟組織損傷和癌變風險。

綜上所述,HBV感染者隨著肝損傷病情加重可出現腸道菌群豐度和多樣性下降,且HBV感染者腸道菌群豐度和多樣性與AIH和PBC患者均存在明顯差異。然而,受條件限制,本研究樣本量納入樣本量偏小,導致研究結果存在一定局限性,需要后續加大樣本量做進一步驗證,以更好地做好CHB感染者疾病控制和不良結局預防。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。