三丁基錫對雌性斑馬魚肝脂的影響研究

趙金剛，楊玉瑩

(長江大學，湖北 荊州 434023)

隨著規模化和集約化新養殖模式的推廣，水產養殖業發展迅速，然而由于存在養殖方式不合理以及環境污染等問題，造成養殖魚體脂過度沉積的現象越來越多(程漢良等，2006)。過多的脂肪沉積不僅會影響魚的品質，而且還會導致魚免疫機能受損，患病概率增加，從而造成較大的經濟損失。環境中多種污染物，包括有機錫均能夠干擾脂類代謝，引起體內脂肪增加，這些化合物在低濃度暴露時，通過干擾脂肪生成的關鍵核受體，導致脂肪堆積，而三丁基錫(TBT)是環境內分泌干擾物中對動物有致肥胖作用的一種代表性物質。有研究發現TBT 暴露能夠導致肝臟DNA 損傷，進而導致肝細胞凋亡，嚴重影響肝臟的功能(王云等，2007)。也有研究表明，從鱈魚肝臟提取的混合物能夠誘導斑馬魚體重增加，并干擾體脂調節(Lyche J L等，2011)，表明環境內分泌污染物可能與魚脂肪過度沉積有關。TBT作為環境污染中環境內分泌干擾物質的代表，研究其對于脂類代謝的影響及其作用機制具有重要意義。因此，筆者選擇環境內分泌干擾物TBT，在環境水平下進行長時間暴露，以探究其與魚脂肪過度沉積的關系，為保護水生態環境和漁業資源提供理論依據。

一、材料和方法

1.試驗材料

(1)試驗動物。選用的斑馬魚為同一批次體形基本相近的雌魚，個體重為(0.25±0.07)克。每組隨機選取40尾雌魚，先在含60升清潔沙濾海水的水族箱中暫養15天，連續充氣增氧，再選取30尾活力好的個體進行成魚污染試驗。經測量魚體長、體重后分缸飼養，保持水溫在26～28℃，設置對照組和不同濃度梯度的試驗組。每缸9 升水，每天換水4.5升，添加TBT暴露液9微升。

斑馬魚分別于不同濃度TBT的水體中飼養，飼養水體每天更換1/2，并清除魚排泄物。早期幼魚用草履蟲投喂飼養，后期用豐年蟲投喂飼養。每天飼喂兩次，上午8 點、下午6 點各1次，每次適量喂食。

(2)試劑。TBT 純度≥95%，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、香蘭素、三油精、膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、PBS 緩沖溶液、MS-222 麻醉劑、磷酸—香蘭素。

(3)試驗儀器。電子天平、96 孔“U”形微量反應板、量筒、移液器(10、50、200、1 000 微升)、酶標板、比色皿、洗滌瓶、250毫升燒杯、容量瓶(250、1 000毫升)、膠頭滴管、試管、試管架，UV-300紫外分光光度計、酶標分析儀。

(4)溶液配置。①TBT 暴露液。先用無水乙醇配制成一定濃度的儲備液，避光于4℃保存，試驗前用無氯自來水分別配置成1、10、100 納克/升3種濃度的TBT 暴露液。對照組只加無水乙醇，無水乙醇的終濃度為1 微升/升。②中性甲醛配制。10毫升甲醛(37%～40%)中加入90毫升雙蒸水、4克磷酸二氫鈉、6.5克磷酸氫二鈉。③磷酸鹽緩沖液(PBS)。稱取8克氯化鈉、0.2克氯化鉀、3.63克磷酸氫二鈉和0.24克磷酸二氫鉀，先溶于800毫升雙蒸水，然后用鹽酸調pH 至7.4，雙蒸水定容至1 升。④4%多聚甲醛(PFA)。稱取40克PFA，置于三角燒瓶中，加入500～800毫升PBS，加熱至60℃左右，持續攪拌，使粉末完全溶解，滴加少許氫氧化鈉溶液使溶液清亮，最后補足0.1摩爾/升的PBS于1升，充分混勻。⑤磷酸—香蘭素。0.12克香蘭素加入20毫升水，充分溶解后用85%磷酸定容至100毫升。

2.方法

(1)暴露試驗。培養期間采用自然光周期，溫度控制在26～28℃。雌斑馬魚分別置于不同濃度的TBT水體中培養。培養期間，每天夜里換1/4 體積的水體，重新添加TBT使各組濃度保持不變，對照組添加無水乙醇，無水乙醇的終濃度為1 微升/升。養殖40天后收集各組魚，用蒸餾水沖洗，除去殘留毒物。

(2)測量魚體長、體重。每組隨機抓取3尾魚，用適宜濃度的麻醉液進行麻醉。之后測量魚體長；用吸水紙吸干魚體表的水，再用電子天平測量體重，測量后記錄數據。

(3)斑馬魚的解剖。將麻醉過后的斑馬魚用大頭針固定在石蠟培養基上，注意不能傷害內臟，可以將大頭針插在斑馬魚頭部和尾部。未解剖的雌性斑馬魚須用冰塊冷凍保存。使用眼科剪沿魚體腹部剪開，用鑷子掀開腹部皮膚，暴露出腹腔，分離出肝臟和性腺，放入PBS溶液中保存。

(4)檢測總脂質、甘油三酯、膽固醇。將提取的組織用勻漿器研磨均勻，研磨液倒入小試管，用2∶1 的氯仿、甲醇洗滌勻漿管，研磨后可用2∶1 的氯仿、甲醇混合液進行組織勻漿，萃取脂質。萃取物中加入0.88%氯化鉀，靜置過夜。為防止試管溶液揮發，可用塑料保鮮膜覆蓋在試管頂部。經過靜置過夜的組織液，小心移除上層液相層，在下層的有機相層中加入氯仿、甲醇、水(3∶48∶47)洗滌、萃取，靜置一段時間。待溶液完全分層后，用移液器穿過上層液，直接抽取下層液體。將下層液抽取出來3等分，分別置于3支試管中，做好標記。最終的萃取物用氮吹儀在氮氣的保護下吹干，加入100微升雙蒸水，用于脂質的測定。

檢測總脂質：每個試驗樣本各取1支試管用于總脂質的測定。脂質的測定采用Tietz(1976)的方法。在每個待測的樣品中加入2毫升硫酸，沸水浴10分鐘，室溫水浴冷卻5分鐘；然后加入磷酸—香蘭素試劑，37℃水浴15分鐘，室溫水浴冷卻10分鐘；用雙蒸水調零，在UV300 紫外分光光度計540納米吸收波長處讀取光密度。以梯度稀釋的三油精(10～100微克)作為標準，繪制標準曲線，并計算脂質含量。

檢測甘油三酯：甘油三酯的測定采用甘油三酯測定試劑盒(酶偶聯比色法/單試劑型)取3 微升待測樣品，在每個待測的樣品中加入300微升檢測試劑，混勻，置37℃水浴5分鐘，以空白管校零，在酶標儀570 納米波長下比色讀取各管吸光光度值，計算甘油三酯含量。

總膽固醇的檢測：采用總膽固醇測定試劑盒(酶偶聯比色法/單試劑型)取3 微升待測樣品在酶標儀570納米波長下，利用終點法檢測各管的吸光光度值，計算總膽固醇的含量。

二、結果

1.TBT暴露對雌性斑馬魚肥滿度的影響

當TBT 濃度為1 納克/升和100 納克/升時，基本沒有引起肥滿度發生變化，當TBT 濃度為10 納克/升時引起雌性斑馬魚肥滿度升高，但差異不顯著。

2.TBT暴露對雌性斑馬魚肝臟脂質的影響

當TBT 濃度為1 納克/升時，雌性斑馬魚總脂質含量差別不大，而TBT 濃度為10 納克/升和100 納克/升時，肝臟的總脂質顯著增加，表現出顯著性變化(P＜0.05)，分別是對照組的1.4 倍和2.67倍。與對照組相比，TBT暴露未使雌性斑馬魚肝臟中甘油三酯含量呈現顯著性變化，但隨著TBT濃度的升高，雌性斑馬魚肝臟中甘油三酯的含量逐漸上升。當TBT濃度為10納克/升和100納克/升時，雌性斑馬魚膽固醇含量有所降低，但差異不顯著。當TBT 濃度為1 納克/升時，雌性斑馬魚膽固醇含量顯著增加(P＜0.05)，為對照組的1.4倍。

三、討論

通過比較雌性斑馬魚甘油三酯的含量，能更直觀地發現TBT 的誘導致肥作用。隨著TBT 濃度的增加，試驗組雌性斑馬魚甘油三酯含量隨之而增加。乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)在哺乳動物脂肪酸合成和分解代謝中發揮著重要作用(lnagaki T，2007)。Murondoti A(2004)證實，ACC 在奶牛肝臟中脂肪酸的合成及氧化代謝起著關鍵作用，ACC的mRNA 表達水平對于研究奶牛酮病、脂肪肝等物質代謝障礙性疾病具有重要意義。ACC1 和ACC2 催化乙酰輔酶A 羧化至丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A 是脂肪酸合成的物質基礎，同時也是脂肪酸β 氧化的抑制劑。韓春春等(2006)研究證實，ACC1 主要調節脂肪酸的合成，在脂肪生成活躍的組織中表達，如肝臟、脂肪組織和乳腺。ACC2 主要調節脂肪酸的氧化，WonKeun(2005)也證明了只有ACC2產生的丙二酸單酰輔酶A水平的下降在脂肪酸氧化的下降中起關鍵作用。所以肝臟中ACC1 的特異性缺失能夠導致脂肪生成和甘油三酯積累的減少，但不會影響脂肪酸的氧化。SCD1 是單一不飽和脂肪酸合成的限速酶，由SCD1 合成的單一不飽和脂肪酸是關于各種脂類(如磷脂)、甘油三酯和膽固醇酯合成的主要底物。本試驗中，試驗組中甘油三酯的含量低于對照組中的原因可能是TBT對肝臟脂代謝中多種因子共同作用的結果。

通過比較各雌性斑馬魚組膽固醇含量，可以發現當TBT 濃度為1 納克/升時，膽固醇含量明顯升高，其他各試驗組與對照組相比沒有太大變化，表明在相對較低濃度TBT的情況下，能使膽固醇含量增加得更明顯。膽固醇在體內有著廣泛的生理作用，但當其過量時便會導致高膽固醇血癥，對機體產生不利影響，表明低濃度的TBT對于魚的生長有著更大的潛在危害性。試驗結果發現，環境水平TBT暴露魚體后，與對照組相比甘油三酯含量并沒有顯著增加，相反卻有所下降，而魚體總膽固醇含量卻顯著上升，特別是1 納克/升組的魚體。有研究表明TBT 是RXR/PPARγ 的異源二聚體受體的調節劑。RXR 有3種亞型，即RXRα、β、γ，在肝臟中富集的是RXRα 異構體。RXRα是一種獨一無二的核受體，在多個細胞通路中與其他核受體組成異源二聚體，肝臟在脂肪代謝中具有至關重要的作用，因此對脂代謝的調節也發生重要的影響(Kanayama T，2005)。而肝臟又是脂肪代謝的主要器官，因此環境水平的TBT暴露造成了總脂質含量的增加。肝臟中乙酰輔酶A羧化酶的特異性缺失能夠導致脂肪生成和甘油三酯積累的減少，但不會影響脂肪酸的氧化，而脂肪酸是脂類(如磷脂、甘油三酯和膽固醇酯)合成的主要底物，因此造成了膽固醇的增加。