培養條件對雪茄煙優勢菌株ZLX10 生長的影響

潘 勇，張貝貝，周亞彬，胡 捷，景玉輝，李林林，黃友誼，王 劍

（1.湖北中煙工業有限責任公司，湖北 武漢 430040；華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430077；3.華中農業大學園藝林學學院，湖北 武漢 430077）

【研究意義】近年來，雪茄煙因自身低害、風味特別而備受青睞，進入迅速發展階段，生產規模不斷擴大。而當前采收調制后的雪茄煙葉具有雜氣較多、刺激性較大和燃燒性較差等缺點，不能直接用來卷制雪茄，需采用堆垛發酵來改善其香味、吃味等品質［1］。長期以來，雪茄煙葉堆垛發酵完全依賴于傳統自然發酵，發酵中的微生物來源于煙葉和環境，易受環境條件的限制，發酵品質不易控制，安全性差，無法滿足擴大生產的需要。為此，人工選育雪茄煙優勢菌株，開展優勢菌株生長條件等優化，實現人工接菌發酵雪茄煙葉，將是雪茄煙產業發展的必然方向。【前人研究進展】現階段造成雪茄煙葉品質較低的主要原因是煙葉中蛋白質、淀粉、纖維素等大分子物質的含量過高，致使煙葉刺激性較強、青雜氣重、吸味辛辣、澀口，并使煙葉的香氣不能顯露［2-3］。在堆垛發酵中，借助微生物的作用將使這些大分子物質轉化成各種小分子甚至揮發性物質［4-8］，煙葉品質得到提高。研究表明，接種微生物發酵煙葉能夠降解西柏烯類［9］、類胡蘿卜素［10］等煙草香味前體物，還有一些可以有效降解煙堿、甾醇、香豆素等有害化學成分，以此改善雪茄煙葉的外觀質量［11-12］，并提高抽吸時的味道和香氣質量［9-10］，顯著提升發酵品質［13-14］，降低有害物質的含量［15-16］。此外，人工接種微生物發酵可以有效縮短煙葉發酵周期，提高工業化生產效率。微生物應用于煙葉發酵的前提是能夠獲得更多的菌體，其關鍵是探究適合微生物生長的環境。多項研究表明，將微生物應用于煙葉發酵前均會對其培養基、接種量、發酵時間和pH等因素進行優化［6,17-18］，在應用微生物的其他領域也會對微生物的生長環境進行優化，使其處在最佳狀態或者提高微生物菌株的某種功能［19-24］。【本研究切入點】人工接菌發酵是煙葉未來工業化生產的必然趨勢，為此我們開展了雪茄煙優勢菌株的選育，從中篩選出1 株具有降解淀粉和蛋白質的優勢菌株ZLX10，并進行菌株的鑒定和培養條件優化，為規模化接種發酵雪茄煙葉提供應用基礎。【擬解決的關鍵問題】實現人工接菌規模化發酵雪茄煙葉，需先大量制備菌種，提前優化優勢菌株生長條件，尤其是培養基組成和培養條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為本課題組從成品雪茄煙支中篩選的一株對淀粉和蛋白質具有顯著降解效果的優勢菌ZLX10。采用牛肉膏蛋白胨固體和液體培養基（牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、固體瓊脂20 g/L、蒸餾水 1 000 mL、pH 7.0）活化和擴大培養菌種。試驗于2022 年4 月在華中農業大學微生物農藥國家工程研究中心完成。細菌鑒定試劑盒由青島海博生物有限公司生產，其他試劑均為國產化學純。

1.2 菌株培養

將優勢菌株ZLX10 保存在牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，挑取單菌落，以牛肉膏蛋白胨液體培養基進行振蕩培養8～12 h，培養溫度為37 ℃，獲得菌株培養液。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株測序鑒定 將優勢菌ZLX10 的培養液以4 000 r/min 離心5 min，收集菌體，用苯酚氯仿抽提法提取基因組DNA。以提取的基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增引物為細菌16S rDNA 基因測序通用引物27F/1492R，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，并由該公司完成測序。測序結果在NCBI 數據庫進行序列比對分析，選擇同源性最高的物種作為鑒定結果。

1.3.2 菌株生理生化特性測定 參考《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏系統細菌學手冊》的方法［25-26］，采用青島海博生化試劑盒檢測菌株的生理生化指標，包括耐鹽性、檸檬酸鹽利用、丙酸利用、氧化酶、接觸酶、甲基紅、V-P 測定、淀粉水解、葡萄糖氧化培養、硝酸還原、明膠液化、吲哚試驗和產H2S 試驗，具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.4 菌株培養條件優化

1.4.1 培養基成分的種類篩選 以液態牛肉膏蛋白胨培養基為基礎，對培養基中原有成分碳源（葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、乳糖和木糖）［27-28］、氮源（有機氮源大豆蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、尿素和無機氮源硫酸銨、硝酸鉀）［29-30］和無機鹽（硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、碳酸鈣、硫酸銨）的濃度分別進行單因素試驗，分析其對菌株生物量的影響。碳源和氮源的添加濃度均為15 g/L，無機鹽的添加濃度為1.5 g/L，以37 ℃、180 r/min 培養24 h 后測定培養液的OD600值。

1.4.2 培養基成分的濃度篩選 確定最佳碳源、氮源和無機鹽的種類后，分別比較其不同濃度對菌株生物量的影響。碳源、氮源濃度梯度均為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，無機鹽的濃度設0.05～1.25 g/L 共7 個梯度，以37 ℃、180 r/min培養24 h 后測定培養液的OD600值。

1.4.3 培養基優化 根據以上培養基的成分和濃度優化試驗結果，選擇氮源、碳源和無機鹽開展3 因素3 水平的正交試驗［L9(34)］，優化篩選出最優培養基配方［31-32］。

1.4.4 培養條件優化 菌株ZLX10選擇裝液量（每250 mL 裝30、50、70 mL）、接種量（1%、2%、5%，V/V）、種齡（12、18、24 h）進行3 因素3 水平正交試驗（L9(34)）優化［31,33］，篩選最優培養條件。

1.4.5 培養條件驗證 菌株ZLX10 以優化前的培養條件和優化后的最佳培養條件進行接種培養，將培養液稀釋成系列濃度，涂布計數，對比優化前后培養液中的活菌數。

1.5 數據分析

數據整理和圖表制作使用Excel 2009、GraphPad Prism7.0 進行分析與繪制。所有試驗均3 次重復。

2 結果與分析

2.1 ZLX10 菌株的鑒定

對從雪茄煙支中篩選出的優勢菌株ZLX10的16S rDNA 進行測序，經在NCBI 數據庫進行比對分析，顯示菌株ZLX10 與莫海威芽孢桿菌Bacillus mojavensis（MT043920.1）的序列同源性達到99.86%，據此初步確定優勢菌株ZLX10 為芽孢桿菌。進一步分析其芽孢桿菌生理生化特性，由表1 可知，菌株ZLX10 耐鹽，能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，不含丙酮酸脫羧酶，葡萄糖氧化發酵為氧化型；該菌株的淀粉水解和明膠液化均為陽性，表明該菌株具有較強的多糖和蛋白大分子降解能力；此外，該菌株的丙酸利用、氧化酶、接觸酶、吲哚試驗等均為陰性。綜合可知，優勢菌株ZLX10 為莫海威芽孢桿菌Bacillus mojavensis（MT043920.1）。

表1 菌株ZLX10 的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZLX10

2.2 培養基對菌株ZLX10 生長的影響

2.2.1 不同碳源對菌株ZLX10 生長的影響 以牛肉膏蛋白胨培養基作為基礎培養基，分別選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉和乳糖作為碳源，添加量均為15 g/L，無機鹽和氮源保持不變，進行液體振蕩培養。由圖1A 可知，不同種類的碳源對ZLX10 的生長有顯著影響；菌株ZLX10 由蔗糖培養的培養液吸光度最大、為6.425，比葡萄糖培養液高45.88%，比麥芽糖培養液高47.59%，比甘油培養液高43.7%，比乳糖培養液高77.29%，并與其他種類差異顯著，為最佳碳源。

進一步選擇不同濃度的蔗糖培養菌株ZLX10，結果（圖1B）顯示隨著蔗糖濃度升高，菌株ZLX10 培養液的吸光度也隨之升高；當蔗糖添加量為60 g/L 時，菌株ZLX10 培養液的吸光度達到最大、為10.672，并與其他濃度處理之間有顯著差異，因此蔗糖的最佳濃度為60 g/L。

圖1 不同碳源（A）和不同濃度蔗糖（B）培養的菌株ZLX10 生物量Fig.1 Biomass of strain ZLX10 cultured by different carbon sources (A) and sucrose concentrations (B)

2.2.2 不同氮源對菌株ZLX10 生長的影響 以牛肉膏蛋白胨培養基為基礎培養基，選取4 種有機氮源和兩種無機氮源培養24 h，結果如圖2A 所示。將酵母提取物作為氮源時，菌株ZLX10 培養液的吸光度最大、達到9.873，與其他氮源間存在顯著差異；尿素、硫酸銨和硝酸鉀分別作為氮源時，幾乎沒有吸光度；大豆蛋白胨的吸光度高于蛋白胨的吸光度，因此最佳氮源選擇酵母提取物。以不同濃度的酵母提取物培養菌株ZLX10，結果如圖2B 所示。隨著酵母提取物濃度上升，培養液的吸光度逐漸升高；當酵母提取物添加量升至15 g/L 時，培養液的吸光度最大、達到10.067，與除20 g/L 濃度外的吸光值差異顯著；繼續提高酵母提取物的濃度，培養液的吸光度呈現下降趨勢。確定酵母提取物的最佳濃度為15 g/L。

圖2 不同氮源（A）和不同濃度酵母提取物（B）培養的菌株ZLX10 生物量Fig.2 Biomass of strain ZLX10 cultured by different nitrogen sources (A) and yeast extract concentrations (B)

2.2.3 不同無機鹽對菌株ZLX10 生長的影響 以牛肉膏蛋白胨培養基作為基礎培養基，分別選取NaCl、KH2PO4、FeSO4·7H2O、MgSO4、CaCO3作為無機鹽，氮源和碳源的處理相同，液體培養24 h 后測定OD600，結果如圖3A 所示。FeSO4·7H2O和MgSO4的吸光值相近，差異不顯著，但顯著高于其他無機鹽培養的吸光值。FeSO4·7H2O 在培養基配制過程中溶解度較低，易生成沉淀，不利于微生物生長利用。多次試驗比較顯示，FeSO4·7H2O 的OD 值低于MgSO4的，為此選擇MgSO4作為最適無機鹽。進一步優化MgSO4的添加量，在預試驗中增加MgSO4添加量，發現均不利于菌株ZLX10 生長，而降低添加量卻有利于菌株ZLX10 生長，故在0.05～1.25 g/L 濃度區間設7個添加量梯度。結果（圖3B）顯示，隨著MgSO4添加濃度的增加，菌株ZLX10 培養液的生物量整體呈現先增加后降低的變化趨勢；當濃度為0.25 g/L 時，菌株ZLX10 培養液的生物量最高，且明顯高于其他濃度，確定MgSO4的最優濃度為0.25 g/L。

圖3 不同無機鹽（A）和不同濃度硫酸鎂（B）培養的菌株ZLX10 生物量Fig.3 Biomass of strain ZLX10 cultured by different inorganic salts (A) and MgSO4 concentrations (B)

2.2.4 碳源、氮源和無機鹽對菌株ZLX10 生長的影響 根據以上培養基的成分和濃度優化的試驗結果，選擇蔗糖（50、60、70 g/L）、酵母提取物（10、15、20 g/L）、MgSO4（0.20、0.25、0.30 g/L），開展3 因素3 水平的正交試驗［L9(34)］，選出菌株ZLX10 培養基最優配比。由表2 可知，各因素對生物量大小的影響為酵母提取物＞MgSO4＞蔗糖。其中最優組合為A1B3C2，即菌株ZLX10 的最優培養基配方為：蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、MgSO40.25 g/L。

表2 菌株ZLX10 培養基主要因素正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of main factors in culture medium of strain ZLX10

2.3 不同培養條件對菌株ZLX10 生長的影響

對菌株ZLX10 開展種齡、接種量和裝液量的3 因素3 水平正交試驗［L9(34)］，試驗結果如表3 所示。由表3 極差分析可知，各因素對生物量大小的影響為裝液量＞種齡＞接種量，其中最優組合為A3B1C1，即菌株ZLX10 的最優培養條件為接種量1%（V/V）、裝液量30 mL、種齡24 h。

表3 菌株ZLX10 培養條件主要因素正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of main factors under culture conditions of strain ZLX10

2.4 最佳培養條件對菌株ZLX10 生長的影響

綜合以上對菌株ZLX10 最適培養基配比和最適培養條件的研究結果，確定優化后的菌株ZLX10 培養基為：蔗糖 50 g/L、酵母提取20g/L、MgSO40.25 g/L，培養條件為：接種量1%（V/V）、裝液量30 mL、種齡24 h。將菌株ZLX10 在優化后的最佳培養條件下培養24 h 后，生物量是優化前的1.98 倍。

3 討論

3.1 莫海威芽孢桿菌的廣泛應用

從雪茄煙支中分離出的優勢菌株經鑒定為莫海威芽孢桿菌，之前未見報道，但在其他方面報道較多。吳寧［33］從工業大麻籽內生菌中篩選出產很強果膠酶活性的莫海威芽孢桿菌；李曉梅［34］從山西老陳醋發酵過程中篩選出多株產酯、多酚、乙偶姻、酸均較高的莫海威芽孢桿菌優良菌株。還有研究從棉花秸稈中分離到可以降解棉酚的莫海威芽孢桿菌，對棉籽油具有一定的脫毒作用［35］。劉丹彤等［36］在醋醅模擬培養基中添加莫海威芽孢桿菌川芎嗪生成量顯著提高。莫海威芽孢桿菌可以產生抑菌成分，可以拮抗金黃色葡萄球菌［37］。還有研究指出，從醉馬草（Achnatherum inebrians）［38］、矮生嵩草（Kobresia humilis）［39］等內生菌中分離鑒定的莫海威芽孢桿菌，對馬鈴薯的炭疽病菌、壞疽病菌、枯萎病菌均有較好拮抗作用［40］，可以作為生防菌。湯茜等［41］從土壤中篩選到的1 株具有良好降解氯蟲苯甲酰胺能力的莫海威芽孢桿菌。侯寧等［42-43］從受石油污染的土壤中選育出1 株具有較強破乳能力的莫海威芽孢桿菌，其24 h 破乳率大于83%。有報道指出，莫海威芽孢桿菌是引起鐵皮石斛組培苗污染的內生細菌［44］。由此可見，不同來源的莫海威芽孢桿菌具有不同的功能特性，來源于雪茄煙中的莫海威芽孢桿菌也可以用于發酵雪茄煙葉。

3.2 莫海威芽孢桿菌的生長條件

能夠作為微生物碳源的物質很多，對于大多數微生物來說糖類是最好的碳源。有機氮源可提供菌株對各種生長因子的需求，酵母提取物是公認的優良有機氮源［33］。微生物生長繁殖和代謝產物的合成都需要無機鹽，不同無機離子對不同菌株生長產生不同影響［31］，不同來源的莫海威芽孢桿菌對生長條件要求一定差異存在。莫海威芽孢桿菌ZA1 的最佳培養基配比為氯化銨14.25 g、玉米粉19 g、馬鈴薯237 g、水1 000 mL、pH7.7，最佳增殖培養溫度為28 ℃、轉速為180 r/min、發酵時間為36 h，優化后的活菌數為4.12×1010CFU/mL［45-46］。也有報道指出，生防菌莫海威芽孢桿菌ZA1 分泌抑菌物質的最佳培養基為馬鈴薯200 g、蛋白胨10 g、蔗糖20 g、水l 000 mL、pH6.9，最佳培養溫度為17.8 ℃，裝液量為20 mL/150 mL 三角瓶，培養方式為暗處理振動培養，培養時間為96 h［47］。莫海威芽孢桿菌J7 產生抑菌物質的最適發酵培養基為Landy 培養基，其中蔗糖和酵母浸粉分別為最適碳源和氮源，30 ℃、36 h 培養、培養基初始pH 7.0、接種量6%為最適發酵條件［48］；其中蔗糖添加量、酵母浸粉添加量和發酵溫度是影響莫海威芽孢桿菌J7 抑菌物質產生的3 個主要因素；經過優化后的蔗糖添加量為16.9 g/L，酵母浸粉添加量為6.6 g/L，發酵溫度為29.7 ℃，其他成分不變，優化后等量培養基內的抑菌物質產量提高了38.89%。莫海威芽孢桿菌作為破乳菌體生長的最佳發酵條件為培養溫度25 ℃、搖床轉速160 r/min、pH 9、接菌量10%、培養時間40 h［49］。由此可見，培養基成分和培養條件對莫海威芽孢桿菌的生長有明顯影響，因此對來源于雪茄煙中莫海威芽孢桿菌進行生長條件優化具有必要性。

4 結論

經16S rDNA 測序和生理生化鑒定，從雪茄煙支中分離的菌株ZLX10 為莫海威芽孢桿菌。碳氮源為微生物生長代謝過程中必不可少的營養物質，選擇適合菌株生長的培養基對于菌株生物量的提升有重要意義。本研究對菌株ZLX10 的培養基配方和培養條件進行優化，研究了不同碳氮源種類、不同碳氮源濃度和重要無機鹽濃度，以及裝液量、接種量和種齡對菌株ZLX10 液態培養生物量的影響，結合單因素試驗和正交試驗得到更佳的菌株培養工藝。菌株ZLX10 培養基配方為：蔗糖 50 g/L、酵母提取物20 g/L、MgSO40.25 g/L；培養條件為：接種量1%（V/V）、裝液量250 mL中裝30 mL、種齡24 h。菌株ZLX10 在優化后的培養條件下培養24 h 后，生物量是優化前的1.98倍。研究結果為大規模培養菌株實現人工接種發酵雪茄煙葉提供了應用基礎。