跑臺運動對db/db小鼠心肌PPARα信號通路的影響研究

孫 易 ，張 怡 ，丁樹哲 *

糖尿病是目前世界上最常見的慢性疾病之一。糖尿病心血管并發癥是導致糖尿病患者死亡的主要原因，且其發病機理在于代謝失調和胰島素抵抗的共同作用（楊宗璐 等，2021；Young et al.，2002）。心肌細胞具有很高的能量需求，其中大部分是通過脂肪酸氧化獲得的，其余30%來自于葡萄糖和乳酸代謝（Neely et al.，1972）。然而，對于糖尿病患者來說，葡萄糖攝取、糖酵解和丙酮酸氧化等過程受到抑制，脂肪代謝活動上調，從而產生心肌脂變、過量ROS 生成和心肌細胞死亡等問題。已有研究認為，作為決定脂肪酸氧化能力的重要代謝因子（Bugger et al.，2014），過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）可能通過激活脂肪酸攝取和β 氧化相關基因調控糖尿病心肌代謝（Finck et al.，2002； Lee et al.，2017）。有證據表明，PPARα-/-小鼠不易發生糖尿病誘導的心臟肥大，而心臟特異性PPARα 過表達的糖尿病小鼠則表現出心肌細胞脂質堆積（Finck et al.，2003； 蔡歡 等，2016）。此外，miR-30c 及GLP-1（glucagon-like peptide-1，胰高血糖素樣肽-1）也被認為通過PPARα 信號通路參與改善糖尿病心肌病（Wu et al.，2018；Yin et al.，2019）。運動訓練一直被認為是干預糖尿病溫和、有效的手段，能通過阻礙ROS 堆積、改善線粒體功能、抑制心肌凋亡通路、改善心肌纖維化等途徑改善糖尿病心臟病變和心功能，并促進心肌代謝由脂肪酸氧化向葡萄糖供能轉化（Delfan et al.，2020； Seo et al.，2019； Wang et al.，2020）。然而，目前鮮見探索PPARα 在運動緩解糖尿病心肌代謝失調中作用的研究，且糖尿病和運動干預對PPARα 表達的影響也尚存爭議，考慮這可能與采用的動物模型和運動訓練強度不同有關（陳國慶 等，2014； 張崇林 等，2018；Lee et al.，2010）。

除代謝失調外，胰島素抵抗是導致糖尿病心肌病變發生的另一重要原因，其中，MG53 表達上調可能是導致糖尿病心肌胰島素抵抗的因素之一（齊潔 等，2016； Liu et al.，2015）。MG53 是一種TRIM 家族蛋白，在骨骼肌和心肌中特異性表達。基于轉基因動物模型（MG53Tg及MG53-/-）的研究顯示，作為一種E3 泛素連接酶，MG53 可能通過誘導胰島素受體（insulin receptor，IR）和胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）降解促進胰島素抵抗（Song et al.，2013）。除介導胰島素抵抗外，MG53還被認為抑制糖代謝相關基因表達，上調脂代謝相關基因，且上述過程是通過上調PPARα 及其靶基因實現的（Hu et al.，2018；Liu et al.，2015）。然而，在自然生理病理條件下，MG53 是否參與各組織胰島素抵抗尚未定論。有研究顯示，肥胖及2 型糖尿病患者及模式鼠中可見血清MG53 水平升高，且采用單克隆抗體中和血MG53 能提高db/db小鼠胰島素敏感性（Wu et al.，2019）。

db/db小鼠是一種應用廣泛的自發性2 型糖尿病模型。db/db小鼠的心臟在10～14 周齡時即出現心肌代謝改變、收縮功能減弱等特性，因此適宜用于糖尿病心血管病變相關研究。基于此，本研究探索12 周跑臺訓練對db/db小鼠心肌代謝和胰島素抵抗的作用，并分析PPARα和MG53 在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20 只SPF 級6 周齡雄性db/db（BSK.Cg-Dock7m ＋/＋Leprdb/JNju）小鼠和20 只m/m（C57BLKS/JNju）小鼠，購于南京大學模式動物研究所。db/db小鼠和m/m小鼠系通過雜合子db/m小鼠交配繁殖獲得。在后代的3 種表型中，黑色肥胖者為db/db小鼠，具有2 型糖尿病的典型特征，灰色瘦小者為m/m小鼠，常用作對照鼠，小鼠均經過基因型鑒定。小鼠分籠飼養，環境溫度（22±2） ℃，空氣濕度（50±10）%，12 h/12 h 晝夜節律，自由攝食飲水。適應性喂養1 周后，小鼠隨機分為4 組：db/db對照組（DC，n=10），db/db運動組（DE，n=10），m/m對照組（MC，n=10）和m/m運動組（ME，n=10）。測量并記錄各組小鼠體質量和空腹血糖值。

1.2 跑臺運動干預方案

跑臺運動干預方案以已有研究為基礎（Broderick et al.，2017； Sennott et al.，2008）：第1 周，小鼠以7.0～13.3 m/min 的速度運動15～20 min，一周4 次。第2 周，小鼠以13.3 m/min的速度運動30～45 min，一周6 次，周日休息。第3～12 周，上述運動速度和頻率維持不變，每日連續運動1 h，周日休息。小鼠運動訓練時間為20：00—21：00。在第12 周，再次測量各組小鼠體質量和空腹血糖值。

1.3 腹腔胰島素耐量（IPITT）實驗

末次運動結束12 h 后，每組隨機選取5 只小鼠進行IPITT 實驗。小鼠禁食4 h，從尾部靜脈取血測空腹血糖值（ACCU-CHEK 血糖測試儀）。腹腔內注射胰島素（2 U/kg）后30、60、90、120 min 分別取血并測量血糖值。

1.4 組織獲取

IPITT 實驗結束當天，小鼠過夜禁食。每組隨機抽取3 只小鼠進行胰島素刺激。采用異戊烷（4%～5%）吸入對小鼠進行麻醉，隨后腹腔注射5 U/kg 胰島素，10 min 后取心臟。其余小鼠經眼眥取血后采用頸部脫臼法處死，取心臟，沖洗、稱重，迅速裝入已標記的凍存管中，立即置于液氮中速凍，后轉存至-80 ℃冰箱保存待測。

1.5 血清生化檢測

采用IPITT 實驗中所取血液，4 ℃下1 100 g 離心15 min獲得血清。采用試劑盒檢測血清甘油三酯（A110-1，南京建成）和總膽固醇（A111-1，南京建成）含量。

1.6 RNA提取和Real-Time PCR

根據TRIzol（Invitrogen）方法從30 mg 凍存心肌組織提取總RNA。采用分光光度法測量RNA 的濃度和純度。引物（表1）根據NCBI和PrimerBank 設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用TOYOBO FSQ-101 試劑盒從總RNA 反轉錄合成cDNA。采用ABI StepOne 實時熒光定量PCR 儀檢測相關基因的mRNA 表達量，β-actin為內參。數據采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.7 蛋白定量

取30 mg 心肌組織，冰上剪碎，于裂解液中勻漿。4 ℃下12 000 g 離心20 min，取上清液，BCA 法測量蛋白濃度后變性。采用10%分離膠電泳，蛋白轉至PVDF 膜。4 ℃下一抗（表2）孵育過夜，洗膜后室溫下二抗避光孵育2 h。顯影后采用Alpha FC2 凝膠成像系統掃膜并進行灰度值分析，β-actin 為內參。

表2 抗體信息Table 2 Antibodies Information

1.8 數據統計分析

實驗結果以平均值±標準誤表示，統計軟件為IBM SPSS Statistics 23，繪圖軟件為Graphpad prism 7。組間差異采用雙因素方差分析檢驗；糖尿病模型和跑臺運動兩個干預因素間存在交互作用時，采用簡單效應分析（least significant difference，LSD）檢測一個自變量在另一個自變量各水平上的差異。小鼠體質量和空腹血糖在干預前后的差異采用重復測量雙因素方差分析進行檢驗。采用線性回歸對PPARα 蛋白表達與Cpt1b、Acadm、Acadvl、Acaa2和Pdk1 的mRNA 表達間的相關性進行檢驗，并計算相關系數（R）和P。P＜0.05 表示具有顯著性差異。

2 研究結果

2.1 糖尿病和跑臺運動對心臟質量、血清指標和IPITT 的影響

4 個實驗組間小鼠心臟質量無顯著差異（圖1）。MC、ME、DC 和DE 組小鼠血清膽固醇變異系數（coefficience of variation，CV）值分別為8%、13%、25%和22%；MC、ME、DC 和DE 組小鼠血清甘油三酯CV 值分別為13%、22%、13%和18%。盡管個別CV 值較高，但總體符合小鼠血清指標的離散特征。經雙因素方差分析檢驗發現，與MC 組相比，DC 組小鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著升高；與DC 組相比，DE 組小鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著降低。IPITT 測試中，DC 組的曲線下面積（AUC）比MC 組顯著增加，DE 組比DC 組顯著降低。上述結果表明，糖尿病導致小鼠血脂含量增加，胰島素耐量降低，且12 周跑臺運動干預對上述變化有明顯改善作用。

圖1 小鼠基本特征示意圖Figure 1.Basic Characteristics of the Mice

2.2 各組小鼠體質量與空腹血糖的變化

本研究分別在運動干預前（適應性喂養期）和運動干預的最后一周測量各組小鼠的體質量和空腹血糖值。結果顯示（圖2），運動干預前，與MC 組相比，DC 組的體質量和空腹血糖均顯著升高。運動干預后，與MC 組相比，DC 組的體質量和空腹血糖均顯著升高；與DC 組相比，DE 組的空腹血糖顯著降低。與運動干預前相比，運動干預后各組小鼠體質量均顯著增長，DC 組和DE 組空腹血糖顯著升高。

圖2 運動干預前后，小鼠體質量與空腹血糖變化示意圖Figure 2.Changes of Body Weights and Fasting Blood Glucose of Mice Pre and Post Exercise Intervention

2.3 糖尿病和跑臺運動對心功能相關基因mRNA 表達的影響

本研究檢測了ANF、BNF、α-MHC、β-MHC、Actc1、Myl2、Itga5 和Caspase-3 共8 種心功能相關指標的基因表達。結果顯示，與MC 組相比，DC 組ANF 和BNF 的mRNA表達顯著降低，且跑臺運動顯著改善db/db小鼠的ANF 表達（圖3）。與MC 組 相 比，DC 組α-MHC 和β-MHC 的mRNA 表達呈相反的變化，其中，α-MHC 表達降低，β-MHC表達升高；跑臺運動顯著增加db/db小鼠的α-MHC 表達。與MC 組相比，DC 組小鼠心肌Actc1 的mRNA 表達呈下降的趨勢（P=0.051），且跑臺運動對正常鼠和糖尿病鼠的Actc1 表達分別有降低和升高的作用。4 個實驗組間未見Myl2、Itga5 和Caspase-3 的mRNA 表達有顯著差異。

圖3 糖尿病和跑臺運動對心功能相關基因mRNA的影響Figure 3.Effects of Diabetes and Treadmill Running on mRNA Expression of Genes Related to Cardiac Function

2.4 糖尿病和跑臺運動對脂肪和糖代謝以及PPARα信號通路的影響

本研究檢測了PPARα 的蛋白表達，以及脂肪代謝相關酶（Cpt1b、Acadm、Acadvl 和Acaa2），糖代 謝相關酶（Pdk1、Pdk2）和PPARα 信號通路關鍵分子的mRNA 表達水平。結果顯示，與MC 組相比，DC 組心肌Cpt1b、Acadm、Acadvl 和Acaa2 的mRNA 表達均顯著升高；與DC 組相比，DE 組心肌中上述指標的表達顯著降低（圖4）。與MC 組相比，DC 組Pdk1 的mRNA 表達顯著升高；與DC 組相比，DE 組Pdk1 的mRNA 表 達 顯 著 降 低。PPARα 是 脂 肪代謝的關鍵調節因子。與MC 組相比，DC 組PPARα 的蛋白水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組PPARα 的蛋白水平顯著降低。與MC 組相比，DC 組CD36、PGC-1β 和Fabp3 的mRNA 水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組CD36 的mRNA表達顯著降低。

圖4 糖尿病和跑臺運動對脂肪和糖代謝以及PPARα信號通路影響示意圖Figure 4.Effects of Diabetes and Treadmill Running on Metabolism of Fat and Glucose and PPARα Signaling Pathway

2.5 PPARα與Cpt1b、Acaa2和Acadvl之間的相關性分析

本研究對PPARα 的蛋白表達與Cpt1b、Acadm、Acadvl、Acaa2 和Pdk1 的mRNA 表達間進行了相關性分析。結果顯示，PPARα 與Acadm（P=0.55）和Pdk1（P=0.20）間不存在線性相關；PPARα 與Acaa2（P=0.049，R=0.43）和Acadvl（P=0.034，R=0.50）間呈正相關；PPARα 與Cpt1b 間存在相關的趨勢（P=0.072，R=0.40；圖5）。

圖5 PPARα與Acaa2、Acadvl和Cpt1b間的相關性分析Figure 5.Correlation Analysis among PPARα，Acaa2 and Acadvl and Cpt1b

2.6 糖尿病和跑臺運動對MG53的mRNA和蛋白表達水平影響

本研究檢測了MG53 的mRNA 和蛋白表達水平。結果顯示，與MC 組相比，DC 組MG53 的mRNA 表達水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組MG53 的mRNA 表達顯著降低（圖6）。然而，4 個實驗組間MG53 的蛋白表達未見顯著差異。

圖6 糖尿病和跑臺運動對MG53表達影響示意圖Figure 6.Effects of Diabetes and Treadmill Running on the Expression of MG53

2.7 糖尿病和跑臺運動對心肌胰島素抵抗的影響

本研究檢測了胰島素信號通路中β-IR、IRS1 和AKT的總蛋白，以及急性胰島素刺激下磷酸化蛋白表達水平。結果顯示，4 個實驗組間β-IR、IRS1 和AKT 的總蛋白表達無顯著差異（圖7）。與MC 組相比，DC 組胰島素刺激下β-IR 和AKT 的磷酸化水平顯著降低，IRS1 的磷酸化水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組胰島素刺激下β-IR 和AKT的磷酸化水平顯著升高，IRS1 的磷酸化水平顯著降低。MC 組與DC 組間GLUT4 蛋白表達未見顯著差異；與DC組相比，DE 組的GLUT4 蛋白水平顯著增加。

圖7 糖尿病和跑臺運動對心肌胰島素抵抗影響示意圖Figure 7.Effects of Diabetes and Treadmill Running on Cardiac Insulin Resistance

3 討論

心肌底物代謝異常和胰島素抵抗是糖尿病小鼠心臟的顯著病理特征，然而致其發生的分子機制并不完全明確，PPARα 和MG53 在上述過程中的作用也有待進一步探索。本研究中，通過對db/db和m/m小鼠實施12 周跑臺運動干預，PPARα 參與糖尿病小鼠心肌脂肪代謝異常和跑臺運動對脂代謝的改善作用。而與預期不同，在當前實驗背景下，MG53 沒有參與糖尿病心肌胰島素抵抗。

一般認為，心臟肥大、糖尿病心肌病以及心力衰竭等疾病或病理狀態往往伴隨著心臟收縮、舒張功能的變化，同時，若干相關基因也表現出轉錄異常（如α-MHC 和β-MHC）。α-MHC 基因表達下調和β-MHC 基因表達上調與心肌收縮功能受到抑制有關（齊潔 等，2021；Chang et al.，2011； Lasheras et al.，2016；Plante et al.，2015）。本實驗中，可見db/db小 鼠心肌α-MHC 和β-MHC 的mRNA 表達分別降低和升高，此外，跑臺運動顯著緩解了糖尿病所致的α-MHC 轉錄下調。上述結果表明，db/db小鼠心肌收縮功能可能受損，且跑臺運動對其有緩解作用。此外，本研究還檢測了ANF 和BNF 的mRNA 表達情況。ANF 和BNF 是心肌細胞產生的激素，對體外培養的心肌細胞具有抗肥大作用（Gutkowska et al.，2009；Woods，2004）。本研究中，db/db小鼠心肌ANF 和BNF 的mRNA 表達顯著降低，且跑臺運動改善糖尿病小鼠ANF 的mRNA 表達。然而，本研究并未對上述指標的蛋白表達進行檢測，且對小鼠心臟質量進行測量發現，4 個實驗組間未見顯著差異，因此尚不能判斷db/db小鼠是否存在心肌肥大。最后，本研究還檢測了Actc1 的表達水平。Actc1 是編碼α-心肌肌動蛋白的基因，與心臟收縮活動有關。研究顯示，db/db小鼠心肌Actc1 的mRNA 表達有下降的趨勢（P=0.051），且跑臺運動顯著上調db/db小鼠的Actc1 表達，這表明跑臺運動可能使db/db小鼠心肌收縮加強，該結果也與已有證據相吻合（Cox et al.，2013）。然而，跑臺運動下調了對照鼠心肌Actc1 的表達，目前對此尚無合理解釋。心功能相關基因表達的檢測結果表明，本研究中db/db小鼠的心功能與2 型糖尿病的病程發展相吻合，且跑臺訓練對其有改善作用。然而，本研究的不足之處在于，沒有采用超聲心動圖對小鼠的心功能進行直接測定，因此，上述基因表達結果只能作為間接證據，支持跑臺訓練對糖尿病小鼠心功能的正面影響。

有研究表明，糖尿病小鼠存在系統性糖、脂代謝異常，且運動干預能改善甚至逆轉上述變化（劉軍 等，2020）。本研究中，db/db小鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著增加，且跑臺運動顯著降低上述指標。其次，db/db小鼠IPITT 結果的AUC 與對照鼠相比顯著升高，且在12 周跑臺訓練后顯著降低。此外，db/db小鼠的空腹血糖水平也在運動干預后顯著降低。上述結果證實了db/db小鼠存在系統性糖、脂代謝異常，且有氧運動干預可顯著緩解db/db鼠機體糖、脂代謝紊亂，并改善其胰島素抵抗狀態。

除了系統代謝異常外，糖尿病患者心肌的糖、脂代謝也發生紊亂，表現為幾乎完全倚賴脂肪酸氧化以供能（田閣 等，2018）。本研究檢測了小鼠心肌中脂肪氧化相關酶的mRNA 表達，發現db/db小鼠心肌Cpt1b、Acadm、Acadvl和Acaa2 的mRNA 表達上調，且12 周跑臺運動顯著抑制Cpt1b、Acadm、Acadvl 和Acaa2 的表達。上述結果表明，長期有氧訓練能有效逆轉糖尿病胰島素抵抗所致的脂肪酸代謝紊亂。在脂肪氧化供能增加的同時，糖尿病心肌中葡萄糖代謝也受到抑制。事實上，基于人類被試的研究顯示，細胞內脂質濃度與胰島素敏感性呈負相關（Krssak et al.，1999）。脂肪酸氧化增加會激活PDK，隨后磷酸化并抑制PDH（曾芳桂，2017；Lee et al.，2017）。本研究中，可見db/db小鼠心肌Pdk1 的mRNA 表達顯著增加，這可能由脂肪酸氧化增多所致；跑臺運動可顯著下調Pdk1的mRNA 表達，表明運動訓練對心肌糖代謝紊亂的保護作用。此外，本研究還探索了心肌GLUT4 的變化，這是對心肌葡萄糖攝取能力的直觀反映。一般認為，運動對心肌代謝的保護作用部分是通過GLUT4 的上調實現的（許瀚 等，2020；Lehnen et al.，2010； Schaun et al.，2017）。本研究中，12 周跑臺訓練誘導db/db小鼠心肌GLUT4 的蛋白水平上調。然而，對照組小鼠心肌GLUT4 的表達并未因運動發生變化，且這與以往的發現相一致（Osborn et al.，1997）。對上述結果的分析認為，這可能是由于對照組小鼠的GLUT4 水平已經處于正常范圍，因此不會因運動訓練而進一步上調。此外，還有一種可能的原因——由于對照組小鼠的運動能力較高，因此同樣的運動刺激不足以誘導其心肌GLUT4 水平發生變化。

2 型糖尿病動物模型往往表現為心肌脂肪酸攝取、氧化增加，一般認為這主要是由血清脂肪酸、甘油三酯水平升高，以及PPARα 活動增強所致（Bugger et al.，2014）。PPARs 是核脂質激活受體，調控脂質代謝通路的諸多基因（Francis et al.，2003）。在PPARs 的3 種亞型中，PPARα 在肝臟、心臟和骨骼肌中高度表達，并通過轉錄調控脂肪酸代謝相關酶調節脂質和能量穩態。目前，PPARα 在肥胖、高脂膳食（high-fat diet，HFD）等引起的肝臟病變（如非酒精性脂肪肝）中的作用已得到證實，然而鮮見其在心臟中的作用研究。此外，盡管基于轉基因模型的研究認為PPARα 過表達可模擬糖尿病心肌病變（Finck et al.，2003），然而也有證據顯示，有些研究中糖尿病大鼠心肌可見PPARα 表達升高（Lee et al.，2010）。上述矛盾結果的產生可能與模式鼠所處的糖尿病階段不同有關。Saunders 等（2008）認為，糖尿病早期可見心肌PPARα 表達上調，所致的脂肪酸氧化增強有利于維持心肌能量代謝。然而，在糖尿病晚期，心肌細胞對脂肪酸的過量攝取導致PPARα表達下調，同時PPAR-γ 表達上調，從而導致心肌細胞脂毒性加重。本研究發現，19 周齡db/db小鼠心肌PPARα 表達顯著上調。此外，在對PPARα 靶基因［FAT、CD36、FABP和肌肉CPT1 等］的表達水平做進一步檢測發現，此階段db/db小鼠心肌CD36、PGC-1β 和Fabp3 的mRNA 表達均顯著上調，且12 周跑臺訓練能降低db/db小鼠PPARα 和CD36的表達，這表明PPARα 信號通路參與運動訓練對db/db小鼠心肌代謝紊亂的改善作用。此外，相關性分析的結果也佐證了PPARα 對脂質代謝的正調控作用。

作為導致糖尿病心肌病變的另一重要因素，胰島素信號通路受損在本研究中也表現明顯，其中，db/db小鼠心肌AKT 磷酸化受到抑制。此外，12 周跑臺訓練顯著改善了p-β-IR、p-IRS1 和p-AKT 的表達，表明有氧訓練保護并改善糖尿病心肌受損的胰島素信號通路。在調控胰島素信號通路的一系列因子中，MG53 是近年備受關注。已有證據顯示，MG53 參與一系列生理、病理過程，包括心肌和骨骼肌膜修復、心肌缺血預適應以及調控胰島素敏感性等（Zhang et al.，2016）。然而，在體環境中MG53 是否參與介導胰島素抵抗尚存爭議。Song 等（2013）認為，db/db小鼠骨骼肌中可見MG53 表達上調，而Yi 等（2013）認為db/db小鼠MG53 表達與對照組未存在顯著差別，對ob/ob小鼠及2 型糖尿病患者的骨骼肌樣本進行檢驗，也未發現其MG53 的蛋白表達與各自對照組間存在顯著差異。此外，盡管目前鮮見探索運動對MG53 影響的研究，但總體證據支持運動干預下調胰島素抵抗骨骼肌中MG53 的表達。例如，8 周游泳運動能通過下調大鼠MG53 的mRNA 和蛋白表達分別改善HFD 及2 型糖尿病引起的骨骼肌胰島素抵抗（唐艷婕 等，2014； Qi et al.，2016）。盡管如此，運動干預如何影響胰島素抵抗心肌的MG53 表達尚無定論。本研究發現，db/db小鼠心肌MG53的mRNA 表達顯著增加，且12 周運動干預能逆轉此變化。然而，無論是糖尿病還是運動干預均未影響MG53 的蛋白水平。結合本研究中糖尿病和跑臺運動對胰島素抵抗的顯著影響得出：在當前的實驗設定下，MG53 未參與運動訓練對db/db小鼠心肌胰島素抵抗的改善作用。

綜上所述，12 周跑臺運動能顯著改善db/db小鼠心肌底物代謝紊亂和胰島素抵抗狀態，且PPARα 信號通路在糖尿病心肌糖、脂代謝異常中具有重要作用。