抗菌藥物藥效學非臨床研究技術指南

李聰然 楊信怡 王秀坤 胡辛欣 李國慶 游雪甫

摘要：抗菌藥物藥效學非臨床研究屬于抗菌藥物臨床前研究的重要內容，是指研究藥物在體外或體內抑制病原菌生長和復制（抑菌）或使病原菌死亡（殺菌）的作用，主要包括抗菌藥物對細菌的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、殺菌曲線、抗生素后效應和半數有效劑量等測定。本技術指南對抗菌藥物藥效學非臨床研究的常用術語、研究內容及方法進行論述，旨在為創新抗菌藥物，包括化學藥物、生物藥物和中藥的臨床前藥效學研究提供參考。

關鍵詞：抗菌藥物；藥效學；技術指南；抑菌活性；殺菌活性

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Abstract Preclinical pharmacodynamic study of antibacterial agents is an important part of preclinical evaluation of antibacterial agents. It refers to the study of the effect of drugs on inhibiting the growth and replication （bacteriostasis） or killing （bactericidal action） of pathogenic bacteria in vitro or in vivo， mainly including? determinations of the minimal inhibitory concentration， the minimal bactericidal concentration， the time-killing curve， the post antibiotic effect， and the half effective dose. These technical guidelines summarize the common methods for preclinical pharmacodynamic evaluations of antibacterial agents， in order to provide a reference for the preclinical pharmacodynamic evaluations of new antibacterial agents， including chemical drugs， biological drugs， and traditional Chinese medicine.

Key words? ? Antibacterial agents；Pharmacodynamics；Technical guidelines；Bacteriostatic activity；Bactericidal activity

抗菌藥物是臨床最常用藥物之一，抗菌藥物不直接作用于機體，而是作用于機體內的細菌，機體、細菌和抗生素三者之間相互作用、相互制約，因此抗菌藥物藥效學非臨床研究方法不同于其他藥物，有其自身的特點。本技術指南就抗菌藥物藥效學非臨床研究的常用術語、研究內容及相關實驗方法進行論述，包括體外藥效學研究的最低抑菌濃度、最低殺菌濃度、殺菌曲線、抗生素后效應等，體內藥效學研究的全身感染試驗和腿部感染試驗等，同時基于細菌耐藥嚴峻狀況和新藥研發考慮，增加了作用機制、耐藥預測及耐藥機制研究相關內容，以期為創新抗菌藥物研發提供參考和助力。

1 概述

1.1 抗菌藥物的定義

抗菌藥物（antibacterial agents）是指對細菌具有殺菌或抑菌活性的藥物，通常包括來源于微生物次級代謝產物的天然抗生素、在天然抗生素結構基礎上改造獲得的半合成抗生素，以及全合成抗菌藥。

1.2 抗菌藥物臨床前藥效學研究

抗菌藥物臨床前藥效學（pharmacodynamics，PD）研究屬于抗菌藥物臨床前研究的重要內容，是指研究藥物在體外或體內抑制病原菌生長和復制（抑菌）或使病原菌死亡（殺菌）的作用。藥效學研究主要包括抗菌藥物對細菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）、最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）、殺菌曲線（time-killing curves，KCs），抗生素后效應（post antibiotic effect，PAE）和半數有效劑量（50% effective dose，ED50）等測定。

1.3 本技術指南的目的、應用范圍

抗菌藥物臨床前藥效學研究的目的包括以下幾個方面：①評價藥物體外、體內抗菌效果及抗菌特點；②基本揭示抗菌藥物作用靶點及作用機制；③反映藥物用于人體時可能的抗菌藥理效應，為新藥臨床試驗提供重要依據。

本技術指南所涉及的抗菌藥物指具有殺菌或抑菌活性，主要供全身或局部應用的抗菌藥物。本技術指南適用于創新抗菌藥物，包括化學藥物、生物藥物和中藥。

2 體外藥效學研究

體外藥效學研究中的最低抑菌濃度（MIC）測定、最低殺菌濃度（MBC）測定等有國際比較公認的方法，如美國的CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）和歐洲的EUCAST（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）編寫的操作規范。本指南體外藥效學研究方法主要參考這兩個機構的資料以及部分權威專著和文獻，并結合實驗室研究經驗積累編寫。

2.1 最低抑菌濃度（MIC）測定

最低抑菌濃度（MIC）指抑制細菌可見生長的某種抗菌藥物的最低濃度。最低抑菌濃度測定的受試菌一般應選擇近2～3年的臨床分離菌，一些收集困難的菌種可考慮5年內的臨床分離株。受試菌種應包括臨床常見的需氧革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，必要時應包括厭氧菌。受試菌種的總株數視受試藥的類別和抗菌譜特點而定，通常測定創新藥物時不少于1000株，必要時需根據受試菌的耐藥特點（如是否產β-內酰胺酶、是否為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌等）進行分類測定。可選擇同類藥物或具有相似抗菌譜的已知藥物作為對照藥。根據受試藥的抗菌作用水平選擇適當的受試濃度，通常在0.03～128 μg/mL范圍內。藥物配制時按實際活性藥物計算。

MIC測定方法[1-5]有瓊脂稀釋法、微量稀釋法、試管稀釋法等，可根據受試藥物及受試菌的種類選擇適當的測定方法。試驗時應包括廣泛使用的質控菌株，如來自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、英國國家典型培養物保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC）等機構的質控菌株。質控菌株MIC測定結果應在藥敏標準的可接受范圍內。結果描述中需包括抗菌藥物對各種受試細菌的MIC50、MIC90和MIC范圍（MICrange）等，參照表1格式。

2.2 最低殺菌濃度（MBC）測定

在給定條件下培養一定時間（通常為24 h）能殺死大部分接種受試菌（活菌數減少≥99.9%）的最低藥物濃度稱為最低殺菌濃度（MBC）或最低致死濃度（minimal lethal concentration，MLC）。根據抗菌藥物對目標病原菌的MIC測定結果，選擇能體現受試藥物藥效學特點的細菌進行MBC測定。每種細菌應包含敏感及耐藥菌株，通常不少于20株。MBC測定方法主要為試管稀釋法和微量稀釋法等[3，5-6]。結果描述中需包括MBC范圍（MBCrange）、MBC50、MBC90、MBC50/MIC50、MBC90/MIC90、MBC/MIC比值分布等重要指標。

2.3 時間殺菌曲線（KCs）測定

KCs是反映抗菌藥物對受試菌殺菌速率的一種時-效動態曲線。受試菌一般應覆蓋目標適應證的主要病原菌種，每種細菌最好包含質控菌株、敏感菌株、耐藥菌株。

將受試菌接種于培養基中， 接種量約為106 CFU/mL。加入適當濃度的藥物，終濃度通常為1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，置35℃繼續培養，在培養過程中定時取樣， 通常在0、2、4、6、8、12和24 h， 取樣后適當稀釋，涂布瓊脂平皿上計活菌落數， 將菌落數取對數值，繪制時間—菌落數對數曲線即KCs。與初始接種量相比，如果藥物可導致菌計數log10值降低≥3（相當于殺死99.9%以上的初始接種菌），則可判斷藥物具有殺菌活性[3，5-6]。

2.4 抗菌活性影響因素

觀察體外培養條件對抗菌藥物抗菌活性的影響，通常包括培養基的pH、細菌接種量、血清濃度，必要時包括金屬離子（鈣、鎂、鈉等）濃度[5，7]。受試菌一般應覆蓋目標適應證的主要病原菌種，通常為3～5種，每種20～30株。

（1）不同pH的影響：測定培養基不同pH值，如pH5.0、6.0、7.0、8.0和9.0時，對抗菌藥物MIC值的影響。

（2）細菌接種量的影響：測定細菌不同接種量，如細菌接種濃度為103、104、105、106和107 CFU/mL時，對抗菌藥物MIC值的影響。

（3）血清蛋白結合的影響： 測定培養基內不同血清濃度，如血清濃度為0%、25%、50%和75%時， 對抗菌藥物MIC值的影響。

（4）金屬離子的影響：測定培養基內含不同濃度金屬離子，如鈣離子濃度為0、25、50、75和100 μg/mL時，對抗菌藥物MIC值的影響。

2.5 抗生素后效應（PAE）的測定

抗生素后效應（PAE）是指抗菌藥物與細菌短暫接觸后去除受試藥物，在一定時間內細菌生長仍然持續受到抑制的生物效應[8-9]。PAE以時間來衡量，計算公式為PAE=T-C，其中T為給藥組細菌與藥物作用一定時間后，去除受試藥物，菌落數增加十倍（log10值增加1）所需要的時間，C為對照組菌落數增加十倍（log10值增加1）所需要的時間。

根據抗菌藥物MIC和MBC結果選擇受試菌株，應覆蓋目標適應證的主要菌種。每種細菌應包含敏感菌株、耐藥菌株，以及同種細菌的質控菌株。藥物濃度通常為1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC。藥物作用時間視藥物作用特點而定，可從幾分鐘到幾小時不等。去除受試藥物的方式包括反復洗滌、稀釋、過濾和使藥物失活等，其中最常用的方法為稀釋，需要注意稀釋后應確保殘余藥物量不會對細菌生長產生影響。通常1×MIC濃度100倍稀釋即可，更高的藥物濃度則需要1000倍、10000倍稀釋。PAE結果描述中通常需包括PAE曲線圖，以及PAE值等。

2.6 作用機制研究

抗菌藥物作用機制是抗菌藥物臨床前藥效學研究的重要組成，應在條件允許情況下盡可能開展作用機制研究。對于已知結構類型的抗菌藥物，可從結構類似物的已有抗菌機制入手進行研究，如β-內酰胺類抗生素，可以研究其對細胞壁的影響、對β-內酰胺酶的穩定性等。對于全新結構類型的抗菌藥物，或者作用機制存在疑問的抗菌藥物，可以通過誘導耐藥突變株篩選、全基因組測序、突變株突變位點/耐藥機制驗證等來反推抗菌藥物的可能作用機制，再通過分子生物學、酶學、表型等多種方法進行作用機制驗證[5，10-12]。

2.7 耐藥預測與耐藥機制研究

在抗菌新藥研發過程中，應關注新藥的耐藥發展情況及可能的耐藥機制，為新藥上市和臨床應用提供重要依據。耐藥預測與耐藥機制研究[10-14]通常包括：

（1）耐藥頻率測定：取適當濃度菌液（通常為109 ～1010 CFU/mL），100～200 μL/平皿涂布于含不同濃度受試藥物（通常2×MIC～64×MIC）的瓊脂平皿中，培養一定時間（通常為24或48 h）后，記錄耐藥突變菌落數，耐藥突變菌落數與接種活菌落數的比值即為耐藥頻率。

（2）耐藥突變株篩選及耐藥機制分析：將一定量菌液涂布于含不同濃度受試藥物的瓊脂平皿中，每天觀察平皿中突變菌落生長情況，并對突變菌落進行鑒定、耐藥水平測定、全基因組測序、耐藥突變位點分析驗證、耐藥突變株適應性代價測定等，為藥物可能的耐藥情況提供前瞻性預測，并為藥物可能的作用機制提供思路。

（3）連續傳代對藥物MIC值的影響：通常用肉湯法觀察連續傳代對藥物MIC值的影響。方法為將菌株接種于含亞抑制濃度（如1/4×MIC）受試藥物的肉湯中，每天用新鮮含藥培養基稀釋傳代（通常為1：1000稀釋，傳代2～4周）。保存傳代菌液，測定其對藥物的MIC值，觀察隨著傳代次數的增多，藥物MIC值變化的趨勢。

3 體內藥效學研究

抗菌藥物體內藥效學研究分為全身感染試驗和局部感染試驗，后者又包括腿部感染、呼吸系統感染和泌尿系統感染等試驗。本部分內容主要依據比較權威的專著、文獻，并結合實驗室研究經驗積累編寫。

3.1 全身感染試驗

全身感染試驗常用菌液經腹腔或尾靜脈注射引發感染，其中小鼠腹膜炎模型是抗菌藥物研究中的第一個實驗動物模型，也是抗菌藥物體內藥效學研究中的常規實驗模型[5，8，15-16]。

（1）動物：選擇外觀健康的封閉群（如昆明種或ICR）小鼠，體重18～22 g。必要時可選用大鼠、豚鼠等其他動物。

（2）藥物：配制時按實際活性藥物折算含量，對于不穩定的藥物，要現配現用。藥物劑量的選擇可參照藥物的體外MIC結果和已知對照藥的體內療效劑量，并經預試驗確定。原則上藥物給藥途徑應與擬推薦的臨床給藥途徑一致。

（3）感染細菌：根據藥物的抗菌作用特點和體外MIC結果選擇不同的菌種和菌株。廣譜抗菌藥物應包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌各1～2種。創新藥物應包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌各2種以上，每種細菌至少2株，并應包括臨床分離致病菌。選擇能使感染動物全部死亡的最小菌量即最小致死量（minimal lethal dose，MLD）作為感染菌量。小鼠感染途徑通常為腹腔注射、尾靜脈注射。尾靜脈注射通常用生理鹽水菌懸液，而腹腔注射需用含5%干酵母或5%胃膜素（mucin）的菌懸液。

（4）試驗過程：將小鼠按體重隨機分組，每個藥物設4～6個劑量組，另設感染對照組，必要時增設溶媒或賦形劑對照組，每組至少10只，雌雄各半。小鼠腹腔注射（0.5 mL/鼠）或尾靜脈注射（0.2 mL/鼠）100%最小致死量（100% MLD）的菌液引發感染。首次給藥通常為感染后1 h，給藥頻率及次數根據藥物PK/PD特點而定。給藥后觀察動物的活動和反應情況，必要時檢查體溫、體重、局部反應及血液學指標，記錄動物死亡時間和數量，通常觀察感染7～14 d內動物死亡數，計算半數有效劑量（ED50）及其95%可信限，進行統計學分析，并與對照藥進行比較。資料整理可參照表2～3。

3.2 局部感染試驗

評價創新抗感染藥物的體內抗菌活性，僅用全身感染試驗不能滿足新藥評價要求，需要有與臨床感染近似的局部感染試驗。本部分列出了常用的腿部感染、呼吸系統感染、泌尿系統感染試驗的研究方法。局部感染試驗除了上述3種類型外，還有骨髓內感染、心內膜感染、眼角膜感染、蛛網膜下感染、副睪丸感染、肌肉感染、皮內感染、皮下感染等，可參考上述3種類型研究方法進行。

3.2.1 腿部感染試驗

腿部感染[5，8，15， 17-18]一般用小鼠或大鼠經腿部肌肉注射菌液引發感染，感染菌通常選用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等。

（1）感染動物：常用小鼠或大鼠，通常選用環磷酰胺構建免疫抑制狀態動物。

（2）藥物：配制時按實際活性藥物折算含量，藥物劑量可參照藥物的體外MIC結果及已知對照藥的體內療效劑量，并經預試驗確定。原則上藥物給藥途徑應與擬推薦的臨床給藥途徑一致。

（3）感染細菌：根據菌株致病力，將新鮮培養菌液配制為所需濃度的生理鹽水菌懸液作為感染菌液，小鼠腿部肌肉注射菌液引發感染。

（4）試驗過程：以小鼠為例，實驗前小鼠腹腔注射環磷酰胺致免疫抑制狀態。小鼠按體重隨機分組，每個藥物設3～5個劑量組，同時設感染對照組，必要時增設溶媒或賦形劑對照組。每組至少10只動物，雌雄各半。小鼠腿部注射部位消毒后，肌肉注射50～100 ?L的感染菌液進行感染。一般感染后2 h開始給藥，給藥次數、間隔時間根據藥物PK/PD特點及療效而定。末次給藥后18 h處死動物，取腿部肌肉，組織勻漿菌計數法檢查腿部活菌數量，并進行統計學分析。

3.2.2 呼吸系統感染試驗

呼吸系統感染[5，8，15，19-20]（肺部感染）的常用感染方法有滴鼻法、支氣管插管法和感染箱法。療效判斷指標一般包括肺部組織菌計數、動物生存數、肺部炎癥變化、細菌學和組織病理學檢查等。感染菌通常選用肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等。

（1）感染動物：常用小鼠，亦可選用大鼠、豚鼠等其他動物。必要時可選用環磷酰胺構建免疫抑制狀態動物。

（2）藥物：配制時按實際活性藥物折算含量，藥物劑量可參照藥物的體外MIC結果和已知對照藥的體內療效劑量，并經預試驗確定。原則上藥物給藥途徑應與擬推薦的臨床給藥途徑一致。

（3）感染細菌：根據菌株致病力，將新鮮培養菌液配制為所需濃度的生理鹽水菌懸液作為感染菌液，小鼠經滴鼻、支氣管插管等方式感染，體積一般為20～50 ?L/鼠。

（4）試驗過程：以小鼠為例，將小鼠按體重隨機分組，每個藥物設3～5個劑量組，同時設感染對照組等，每組至少10只動物，雌雄各半，動物麻醉后用選定方法感染。首次給藥時間一般為感染后4～12 h，給藥次數根據藥物PK/PD特點及療效而定。末次給藥后18 h，處死小鼠，取出肺，組織勻漿菌計數法檢查肺活菌數量，并進行統計學分析。若需做肺部組織病理學檢查，觀察肺感染后損傷程度，可適當增加每組動物數。

3.2.3 泌尿系統感染試驗

泌尿系統感染[5，15，21-22]常采用上行性腎感染模型，常用方法有膀胱注射菌液上行性腎感染和泌尿道插管注入菌液上行性腎感染兩種。感染菌通常選用大腸埃希菌，也可選用肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等。

（1）感染動物：常用雌性小鼠或大鼠，感染前16～24 h和感染后4～6 h禁水。

（2）藥物：配制時按實際活性藥物折算含量，藥物劑量可參照藥物的體外MIC結果和已知對照藥的體內療效劑量，并經預試驗確定。原則上藥物給藥途徑應與擬推薦的臨床給藥途徑一致。

（3）感染細菌：根據菌株致病力，將新鮮培養菌液配制為所需濃度的生理鹽水菌懸液作為感染菌液，小鼠感染體積一般為10～50 ?L/鼠。

（4）試驗過程：以小鼠為例，將小鼠按體重隨機分組，每個藥物設3～5個劑量組，同時設感染對照組等，每組至少10只動物，動物麻醉后用選定方法感染。首次給藥時間一般為感染后4～6 h，給藥次數根據藥物PK/PD特點及療效而定。末次給藥后18 h處死小鼠，取出雙側腎臟，用腎組織勻漿菌計數法或腎剖面蓋印法檢查腎臟活菌數量，并進行統計學分析。若需做腎臟組織病理學檢查，觀察腎臟感染后損傷程度，可適當增加每組動物數。局部感染資料整理可參考表4。

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作者簡介：李聰然，女，生于1979年，研究員，主要研究方向為抗菌藥物的發現、評價及機制研究，E-mail： congranli@imb.pumc.edu.cn