ST37型艱難梭菌分子流行病學研究

陳熔 呂曉菊

摘要：目的 應用全基因組分析方法對艱難梭菌感染可能的暴發流行進行識別和調查，為艱難梭菌感染防控提供可靠的分子流行病學基礎。方法 對8株ST37型艱難梭菌進行第二代高通量測序，并完成序列的拼接和注釋。通過對其核心基因組進行SNP分析，根據SNP數量以及相關臨床資料分析有無院內暴發流行。同時將Genbank中公布了全基因組序列的艱難梭菌，進行MLST分析，對其分析結果為ST37的菌株與本研究中的8株菌株進行SNP分析比較，了解這8株菌的可能來源。結果 以最早收集的菌株WCHCD770作為參照，其他7株菌株的SNP值，最大為59，最小為38，提示它們并不是近期發生的傳播事件。而這8株菌兩兩相互進行SNP計算，其中WCHCD1577、WCHCD1641僅為10，提示它們可能來源于一個克隆，可能存在院內傳播。通過分析比較這8株菌與Genbank中的其他ST37型艱難梭菌發現，它們的致病決定區（PaLoc）序列完全相同，證實了ST37型艱難梭菌的PaLoc在世界范圍克隆傳播，同時對它們的SNP比較分析，發現WCHCD1577、WCHCD1641、WCHCD1216、WCHCD109、WCHCD159與2006年在愛爾蘭分離的菌株M68的SNP最小，WCHCD770、WCHCD1262、WCHCD1450與加拿大分離的菌株VL-0005的SNP最小。提示這些菌株的可能來源。結論 8株ST37型艱難梭菌可能存在克隆傳播，值得感染防控重視。

關鍵詞：艱難梭菌；抗生素相關性腹瀉；多位點序列分型；單核苷酸多態性

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

Abstract Objective To identify and investigate the outbreak of Clostridium difficile infection using whole genome sequence， and provide basic molecular epidemiology for preventing and controlling Clostridium difficile ST37. Methods High-throughput genome sequencing and annotation of eight clinical isolates of Clostridium difficile ST37 were completed. Single nucleotide polymorphism was analyzed by the core genome. Whether there is nosocomial infection outbreak was analyzed according to the number of SNPs. The whole genome sequence of Clostridium difficile was deposited in Genbank， and multiple locus sequence typing （MLST） was conducted and analyzed. SNP analysis of ST37 strains and our eight clinical isolates were performed in order to understand the possible source of our eight clinical isolates. Results Using the earliest strain WCHCD770 as the reference， we found the biggest SNPs was 59， the smallest one was 38. It suggested that they were not recent spread events. But the smallest SNP of the eight clinical Clostridium difficile strains was 10， which was between WCHCD1577 and WCHCD1641， indicating possible nosocomial transmission. Comparing to other ST37 strains in Genbank， we found Pathogenicity Locus （PaLoc） sequences of all Clostridium difficile ST37 were identical. It was confirmed that PaLoc of Clostridium difficile ST37 was spread around the world. We found the Clostridium difficile strain M68 which was collected from Ireland in 2006 had smaller SNP than WCHCD1216， WCHCD1577， WCHCD1641， WCHCD109， and WCHCD159. At the same time， the strain VL-0005 which was collected from Canada had smaller SNP than WCHCD770， WCHCD1262， and WCHCD1450. This suggested possible strains source. Conclusion This experiment confirmed the possible spread event and source in Clostridium difficile ST37， which was helpful to guide prevention and control of Clostridium difficile.

Key words Clostridium difficile; Antibiotic-associated diarrhea; MLST; SNP

艱難梭菌是引起抗生素相關性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea， AAD）和偽膜性腸炎（pseudomembranous colitis， PMC）的重要致病菌[1-3]。自2001年以來，艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection， CDI）在全球呈上升趨勢，其高毒力菌株PCR-核糖體分型（RT027）感染在北美和歐洲爆發流行[4-5]。亞洲國家對艱難梭菌的研究相對較少，RT027引起的CDI只有零星的報道。相關報道中，RT017（MLST分型屬于ST37）為亞洲主要流行型別[6-7]。而中國大陸目前只有部分大城市醫院有檢測和研究報道[8]。本研究從臨床患者分離獲得8株ST37型艱難梭菌，由于菌株短時間內來源于同一病房，它們之間是否存在院內傳播積極探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集四川大學華西醫院ICU病房2014年8月—12月臨床腹瀉患者大便標本。腹瀉的定義為24 h內出現3次或以上的腹瀉。

1.1.2 儀器與試劑

臺式離心機（德國Eppendorf公司），基因擴增儀、電泳儀（美國Bio-Rad公司），腦心浸出液（BHI）肉湯（青島高科園海博生物技術有限公司），艱難梭菌選擇培養基CCFA、厭氧產氣袋（英國Oxoid公司），細菌DNA提取試劑盒（美國Omega公司），SPAdes（序列拼接軟件），Prokka（基因注釋程序），Jmodeltest、PhyML tools（SNP分析軟件）。

1.2 方法

1.2.1 糞便厭氧培養及鑒定

糞便標本先用75%酒精處理，再接種于CCFA瓊脂平板，放置于塑料密封袋中，再加入厭氧產氣袋，厭氧指示劑，夾上密封夾，置于培養箱37℃孵育48 h。挑取可疑單個菌落傳代接種于CCFA培養基上，厭氧培養48 h后取單個菌落進行涂片、革蘭染色，置顯微鏡下觀察，經生化鑒定為艱難梭菌后，進一步采用PCR技術檢測毒素基因（tcdA和tcdB）。選取7個管家基因（adk， atpA， dxr， glyA， recA， sodA和tpi）進行PCR擴增并測序，將序列與數據庫比對，分析菌株的ST型別。

1.2.2 基因DNA的提取

ST37型菌株根據細菌DNA提取試劑盒說明書操作，提取細菌基因組DNA。

1.2.3 全基因組測序

將提取的艱難梭菌染色體DNA送諾和基因公司進行二代測序，測序數據使用SPAdes和Prokka軟件進行拼接和注釋。

1.2.4 數據分析

使用Jmodeltest和PhyML Tools軟件對收集的ST37型菌株進行SNP分析，了解它們是否來源于同一克隆。同時將我們的菌株與公布了全基因組序列的ST37型菌株共同進行SNP分析，了解它們的來源。同時應用軟件（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）分析菌株基因組中的耐藥基因。

1.2.5 菌株的MIC值測定

按CLSI標準采用瓊脂稀釋法測定抗菌藥物對ST37型菌株的MIC值。

2 結果

2.1 一般資料

研究期間，124例腹瀉患者糞便中共檢測艱難梭菌31例，均為產毒性菌株， 其中tcdA+B+菌株23例（74.2%，23/31），經MLST分型可分為13個STs（ST2/3/8/35/54/208/209/210/211/212/213/214/218）。tcdA-B+菌株8例（25.8%，8/31），經MLST分型均為ST37型。這8株ST37菌株分別命名為（WCHCD109、WCHCD159、WCHCD770、WCHCD1216、WCHCD1262、WCHCD1450、WCHCD1577和WCHCD1641）。所有ST37菌株在分離前均使用過廣譜抗生素，主要來源于老年患者，男女比例為1：1，臨床腹瀉癥狀較輕，伴有腹脹或腹痛。胃腸道疾?。òㄒ腋胃斡不Т鷥?、重癥胰腺炎、腸梗阻術后、肝移植術后）為主要的基礎疾?。ū?）。

2.2 全基因組測序結果

從表2結果中可以看出，這8株菌平均基因全長為5 Mb，平均GC含量為29%，最小的contig數目為120，平均基因預測4000個基因，且大部分在GenBank中能找到序列相同基因。

2.3 基因組SNP比較分析

將這8株菌染色體基因中的核心基因組（約2Mb序列）除去在連接部位以及用Harvest軟件沒有標注“PASS”的，再進一步進行SNP分析，表3為兩兩菌株之間SNPs比較，根據臨床資料，WCHCD770為最早收集的菌株，以其作為參照，圖1代表其他菌株與WCHCD770之間的SNPs進化樹。據艱難梭菌每年進化突變率，設定其SNP大于10時非近期傳播事件。結果分析顯示了菌株間的親緣關系，可見WCHCD1577與WCHCD1641在同一分枝上，其SNPs為10，它們相互親緣關系最近，可能來自同一克隆。而WCHCD770則與WCHCD14-159親緣關系最遠，SNPs為59。 由此可見，全基因組測序SNP分析能將同一MLST型菌株更準確地區分開來，也是克隆傳播分型的最佳方法。

2.4 ST37型艱難梭菌來源分析

對已公布全基因組的艱難梭菌基因庫659株菌進行MLST分析發現，共有8株為ST37，分別是：

DA00065? （ST37; clinical isolate， recovered in 2010， USA， GenBank accession no. AVIU00000000）

P71? （ST37; clinical isolate， recovered in 2009， USA， GenBank accession no. AVMW00000000）；

P74? （ST37; clinical isolate， recovered in 2009， USA， GenBank accession no. AVMY00000000）；

M68? （ST37; clinical isolate， recovered in 2006， Ireland， GenBank accession no. NC_017175）；

E13? （ST37; clinical isolate， France， GenBank accession no. CAMF00000000）；

002-P50-2011 （ST37; clinical isolate， USA， GenBank accession no. AGAA00000000）；

050-P50-2011 （ST37; clinical isolate， USA GenBank accession no. AGAB00000000）；

VL-0005 （ST37; clinical isolate， Canada， GenBank accession no. CZWV00000000）。

將基因庫中的8株ST37 型菌與本研究收集的8株菌做致病性決定區（pathogenicity locus， PaLoc）比較，發現這些菌株的PaLoc完全相同，說明ST37型艱難梭菌的致病性決定基因相對保守。圖2為這16株菌的SNP進化樹分析。從圖中可見WCHCD109、WCHCD159、WCHCD1216、WCHCD1577和WCHCD1641與基因庫中2006年愛爾蘭分離的M68親緣關系最近，而WCHCD770、WCHCD1262和WCHCD1450與基因庫中加拿大分離VL-0005親緣關系最近。這也揭示了菌株的可能來源。

2.5 體外藥敏結果

應用瓊脂二倍稀釋法測定抗菌藥物對8株ST37型艱難梭菌的MIC值的分布范圍，萬古霉素（≤0.03～0.25 ?g/mL），克林霉素（8～>512 ?g/mL），利福平（≤0.03～>512 ?g/mL），莫西沙星（≤0.03～16 ?g/mL），甲硝唑（≤0.03 ?g/mL），四環素（≤0.03～32 ?g/mL） （表4）。

2.6 耐藥基因分析結果

將本研究8株菌的全基因組序列在（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）中分析其耐藥基因（表5），8株艱難梭菌對克林霉素均耐藥，有5株存在ermB耐藥基因，但WCHCD109和WCHCD1577沒有ermB耐藥基因。5株艱難梭菌對四環素耐藥，均存在tet耐藥基因。4株艱難梭菌對利福平耐藥，均存在rpoB耐藥基因。4株艱難梭菌對莫西沙星耐藥，存在gryA或gryB耐藥基因。

3 討論

CDI是目前公認的最重要的院內感染之一，近年來，其發病率病死率在全球呈上升趨勢。艱難梭菌致病主要是由2個毒素基因tcdA和tcdB。歐美國家流行的艱難梭菌以tcdA+B+型菌株為主，亞洲以tcdA-B+型菌株為主。而ST37型為亞洲tcdA-B+型菌株主要的流行特征。本研究顯示，tcdA-B+基因型的全部菌株為ST37型，這與既往ST37型在中國的分子流行病學報道一致[9-10]。藥敏試驗顯示未發現萬古霉素和甲硝唑耐藥菌株，這與既往報道一致，提示CDAD治療的一線用藥仍是萬古霉素和甲硝唑，但需要注意是目前艱難梭菌對這兩種抗菌藥物的敏感性呈逐年降低的趨勢[11-12]。所有菌株均對克林霉素耐藥，克林霉素耐藥機制主要是由編碼23SrRNA甲基化酶的erm基因所介導。但有2株（25%）未攜帶ermB基因，說明尚存在其他的耐藥機制，是否存在外排泵、藥物修飾酶、核糖體蛋白L4或L22的突變等，尚需要進一步研究。

分子分型是監測CDI感染暴發及病原溯源的一種非常重要的方法。目前艱難梭菌常用的分型方法包括脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis， PFGE）、PCR-核糖體分型、多位點序列分型（multilocus sequence typing， MLST）和多位點可變數目串聯可重復序列分析（multiple-locus variable-number tandem- repeat analysis， MLVA）等[13]。但這些傳統方法均存在一定局限性，如分辨力、重復性、可操作性和實驗室間可比性等[13]。近年來，逐漸興起的全基因組測序（whole genome sequenching， WGS）可準確研究細菌進化、流行途徑和菌群分布情況，后續的單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism，SNP）分析可區別菌株間單個核苷酸差異，因此具有更高的分辨力，有助于判別流行菌株是否來源于同一克隆[13]。就艱難梭菌而言，大量的研究表明，平均每個位點每年的突變率是1.47×10?7～5.33×10?7，相當于每個基因組每年的SNP大約為1～2[14-17]。因此，界定SNP值為0～2為近期克隆傳播事件，SNP值大于10具有遺傳差異的[14，18-19]。

本研究對8株同屬ST37型tcdA-B+艱難梭菌進一步研究，探討其是否存在院內傳播，為進一步監測和預防醫院感染爆發非常重要。研究通過WGS和SNP發現以最早分離的菌株WCHCD770作為參照，其他7株與之比較的SNP最小為38，可以認為它們與WCHCD770這株菌并非直接近期傳播。結果表明相同ST型艱難梭菌感染，可能相互之間并沒有進化關系，排除傳播可能。而將這8株菌兩兩之間做SNP分析，發現WCHCD1577與WCHCD1641之間的SNP為10，雖然處于界定標準的邊緣，結合相應臨床資料，WCHCD1577分離菌患者出ICU的時間與WCHCD1641分離菌患者入ICU的時間僅相隔4 d，他們的住院床號相鄰。而在院內感染的環節中，患者雖是傳染源，但醫務工作者處于這個醫療環境中，他們在接觸患者時可通過手或醫療器械將芽孢定植而進行傳播，易于成為潛在的傳播者。通過采集醫務人員的手部標本進行增菌培養，可推斷該菌株在院內的傳播是否是醫務人員的手為媒介。推測這兩株菌可能來源于同一克隆，患者所處的環境可能為其傳播途徑。因此，嚴格正確的手衛生、消毒和及時更換病房用品或醫療器械，有助于減少艱難梭菌的院內傳播。將這8株菌的基因序列與基因庫（Genbank）中已知的ST37型艱難梭菌基因組數據的SNP分析發現，WCHCD109、WCHCD159、WCHCD1216、WCHCD1577、WCHCD1641與愛爾蘭克隆流行菌株M68非常接近，WCHCD770、WCHCD1262和WCHCD1450與加拿大菌株VL-0005也非常接近，推測它們之間可能存在遠期傳播事件。需要進一步了解這些患者的活動軌跡，以獲取菌株來源更為準確的依據。

參 考 文 獻

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基金項目：四川省衛生健康科研課題（No. 19PJ223）

作者簡介：陳熔，女，生于1981年，博士，主治醫師，研究方向為感染性疾病的臨床診療，E-mail： 38824605@qq.com