抗結(jié)核藥物藥效學(xué)非臨床研究技術(shù)指南

朱慧 徐建 郭少晨 陳曦 陸宇

摘要：研發(fā)新型抗結(jié)核藥物極具挑戰(zhàn)性，難度大，周期長，非臨床研究的數(shù)據(jù)是開展臨床試驗的前提。全面充分的結(jié)核分枝桿菌體外和在動物體內(nèi)的藥效學(xué)評價是臨床試驗前的重要步驟和關(guān)鍵內(nèi)容。本技術(shù)指南主要適用于治療由結(jié)核分枝桿菌引起的肺結(jié)核病藥物的研發(fā)，旨在為創(chuàng)新抗結(jié)核藥物的臨床前藥效學(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：抗結(jié)核藥物；藥效學(xué)；技術(shù)指南

中圖分類號：R978.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract? ? The development of new anti-tuberculosis drugs is extremely challenging， difficult and time-consuming. Non-clinical research data is the basis for conducting clinical trials. Comprehensive and adequate pharmacodynamic evaluation of Mycobacterium tuberculosis in vitro and in animals is an important step and key content before clinical trials. This technical essentials are mainly applicable to the research and development of drugs for the treatment of pulmonary tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis， and aims to provide a reference for the preclinical pharmacodynamic research of innovative anti-tuberculosis drugs.

Key words? ? Antituberculosis agents; Pharmacodynamic; Technical guidelines

肺結(jié)核病的傳染源是結(jié)核分枝桿菌，據(jù)WHO估算，全球有接近20億的結(jié)核潛伏感染人群。多藥組合的化學(xué)治療是人類控制結(jié)核病的主要手段，抗結(jié)核治療需要新作用機制的藥物和有效的聯(lián)合治療方案。隨著耐多藥結(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis， MDR-TB），廣泛耐藥結(jié)核病（extensively drug-resistant tuberculosis， XDR-TB）的日益增多，有效的新藥及新方案亟待研發(fā)。研發(fā)新型抗結(jié)核藥物極具挑戰(zhàn)性，難度大，周期長。臨床試驗開始前應(yīng)進(jìn)行非臨床研究，全面充分的結(jié)核分枝桿菌體外和在動物體內(nèi)的藥效學(xué)評價是臨床試驗前的重要步驟和關(guān)鍵內(nèi)容。目前國際上還沒有統(tǒng)一的抗結(jié)核新藥的藥效學(xué)評價方法和標(biāo)準(zhǔn)，我國尚缺乏系統(tǒng)、科學(xué)、規(guī)范的藥效評價技術(shù)指導(dǎo)原則。隨著我國抗結(jié)核新藥研發(fā)的不斷增加以及抗結(jié)核藥物藥效學(xué)評價技術(shù)的不斷成熟和完善，為我國抗結(jié)核新藥研發(fā)臨床前藥效學(xué)研究提供更加精準(zhǔn)的技術(shù)指導(dǎo)，解決藥效學(xué)評價中的重點問題，保證數(shù)據(jù)完整性，中國藥理學(xué)會化療藥理專業(yè)委員會和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院組織國內(nèi)專家制定了《抗結(jié)核藥物藥效學(xué)非臨床研究技術(shù)指南》，為注冊申請人、研究者在規(guī)劃、設(shè)計、實施藥效學(xué)非臨床研究提供技術(shù)指導(dǎo)。

本技術(shù)指南適用于單一抗結(jié)核藥物的研發(fā)，且主要針對肺結(jié)核病用藥，肺外結(jié)核、潛伏感染、預(yù)防性用藥等并不在本指南適用范圍內(nèi)。尤其關(guān)注可以減少敏感結(jié)核療程的，對耐藥結(jié)核病有效的藥物。對于兩藥組合的方案以及固定劑量復(fù)合制劑，可作為參考。

所有與結(jié)核分枝桿菌菌株接觸的實驗操作必須在生物安全實驗室內(nèi)進(jìn)行。抗結(jié)核藥物的臨床前藥效學(xué)研究分為體外活性評價和體內(nèi)活性評價。

1 體外研究[1-4]

1.1 最低抑菌濃度（MIC）測定

體外研究首先需要測定藥物的抗菌活性，包括殺菌、滅菌活性。結(jié)核分枝桿菌生長包括對數(shù)生長期（復(fù)制期）和休眠靜止期（非復(fù)制期）。研究藥物對復(fù)制期細(xì)菌的活性稱為殺菌活性;對非復(fù)制期細(xì)菌的活性則為滅菌活性。描述抗菌活性的重要指標(biāo)之一是最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），MIC測定應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)化方法，有液體培養(yǎng)基中結(jié)核分枝桿菌生長、代謝反應(yīng)檢測方法和傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基表型檢測方法。觀察結(jié)核分枝桿菌生存情況可以通過菌落計數(shù)或熒光檢測的方法，應(yīng)用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d后添加指示劑，添加指示劑后避光培養(yǎng)過夜，通過檢測吸光度來判斷菌株生長情況。應(yīng)用含藥瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行MIC測定的，需要培養(yǎng)3～4周，3～4周后進(jìn)行菌落計數(shù)。菌株應(yīng)具有地區(qū)代表性，并應(yīng)包含有代表性的不同耐藥情況的樣本， 一般應(yīng)選擇近2～3年的臨床分離菌，一些收集困難的菌種可考慮5年內(nèi)的臨床分離株。

1.2 最低殺菌濃度（MBC）測定

最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration， MBC），指在給定條件下培養(yǎng)一定時間能殺死大部分（≥99.9%）接種受試活菌數(shù)的最低藥物濃度。最低殺菌濃度的檢測方法可以通過將MIC實驗中培養(yǎng)菌液原液或稀釋液涂布至不含抗結(jié)核藥物的瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4周觀察能夠殺死結(jié)核分枝桿菌的最低藥物濃度，即MBC。

MIC和MBC均為靜態(tài)觀察藥物或化合物與菌株之間相互作用的評價指標(biāo)，可以作為初步評價化合物的抗結(jié)核活性的指標(biāo)。作為評價抗結(jié)核活性的重要指標(biāo)，MIC和MBC只能提供一個時間點化合物的抗結(jié)核活性，不能全面評價化合物對結(jié)核分枝桿菌生長的作用，具有一定局限性。

1.3 殺菌曲線（time-killing curves）

殺菌曲線可以動態(tài)觀察藥物（化合物）與結(jié)核分枝桿菌相互作用的情況，能夠比較不同濃度化合物在不同作用時間下對結(jié)核分枝桿菌生長的影響，為評價化合物的抗結(jié)核活性提供更多依據(jù)。通過繪制殺菌曲線可以判斷化合物抗結(jié)核活性為時間依賴性或濃度依賴性，為后續(xù)藥動學(xué)（PK）研究和藥動學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）研究提供依據(jù)。菌株可以是結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株或臨床株。初始菌液濃度約為5×105 CFU/mL。當(dāng)評價單一化合物的抗結(jié)核活性時，實驗組中待測化合物濃度需要參考該化合物MIC值進(jìn)行設(shè)定，從低濃度至高濃度，藥物濃度通常為1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，結(jié)核分枝桿菌在含藥培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14 d，期間每隔3～4 d取部分菌液在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)3～4周后進(jìn)行計數(shù)。菌落數(shù)取對數(shù)值作為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制曲線即殺菌曲線。與初始接種量相比，如果藥物可導(dǎo)致菌落計數(shù)降低3個log值及以上（相當(dāng)于殺死99.9%以上的初始接種菌），則可判斷藥物具有殺菌活性。殺菌曲線也用于在體外評價藥物組合中各藥物間的相互作用。

1.4 巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性檢測

結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，需要評價研究藥物的胞內(nèi)殺菌活性。用于結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞系常選用RAW264.7和J774.1兩種。細(xì)胞培養(yǎng)后將結(jié)核分枝桿菌感染，加入藥物處理一般72 h，裂解細(xì)胞；進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌活菌計數(shù)，比較化合物處理組與未經(jīng)化合物處理組及陽性對照藥處理組中巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量。由于測定巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌生長數(shù)量的方法需要裂解細(xì)胞并將裂解液進(jìn)行培養(yǎng)及計算菌落的個數(shù)，因此此方法缺點在于耗時較長。

1.5 結(jié)核分枝桿菌自發(fā)突變率的檢測

在體外研究中，可使用自發(fā)突變率（野生型菌株暴露于藥物下發(fā)生突變的頻率）來評估菌株耐藥的風(fēng)險，但這一方法對體內(nèi)試驗時聯(lián)合用藥的耐藥風(fēng)險可能無法預(yù)測。若使用耐藥菌株評估，風(fēng)險較高且可能對臨床試驗中單藥的設(shè)計產(chǎn)生影響。此方法是將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv培養(yǎng)至對數(shù)生長期后濃縮至108 CFU/mL，取100 μL分別涂布至含藥（含4×MIC藥物濃度）及不含藥7H10固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周后進(jìn)行菌落計數(shù)。計算突變率。

1.6 體外藥效學(xué)相互作用

體外藥效學(xué)相互作用（pharmacodynamic interactions）是指對研究藥物的相互作用、有效劑量進(jìn)行評估，從而確定其進(jìn)一步研發(fā)為肺結(jié)核治療方案藥物的可行性。目前常用的定量方法是棋盤稀釋法。以兩種藥物的相互作用為例，首先分別測定兩個研究藥物對結(jié)核分枝桿菌的MIC，根據(jù)MIC值，設(shè)定最高濃度為單藥的2×MIC，再逐一進(jìn)行2倍稀釋（分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行），每管（孔）中分別是兩種藥物不同濃度組合的混合液，一般設(shè)計6～8個稀釋度。初始接種菌量為5×105CFU/mL，在37℃孵育7 d，觀察結(jié)果并計算部分抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration， FIC）。FIC指數(shù)計算公式（A藥聯(lián)用時的MIC/A藥單測時的MIC）+（B藥聯(lián)用時的MIC/B藥單測時的MIC）。根據(jù)FIC值判斷為協(xié)同作用（＜0.5）、相加作用（0.5～1）、無關(guān)作用（1～2）和拮抗作用（＞2）。

1.7 作用機制

需要對抗結(jié)核藥物的作用機制進(jìn)行研究，從而為其組成有效治療方案提供依據(jù)。作用機制研究方法可參考一般抗菌藥物。

1.8 耐藥性及其機制

結(jié)核分枝桿菌分離株對研究藥物可能產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)捏w外和/或體內(nèi)模型進(jìn)行評估。同時，還應(yīng)關(guān)注交叉耐藥（同類藥物間、與其他類藥物間）。若細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，需要進(jìn)一步研究耐藥機制。在非臨床研究中，如發(fā)現(xiàn)表觀型/基因型的變化，可對其臨床意義嘗試評估，例如體外藥敏。

2 體內(nèi)研究[4-15]

動物模型是研究藥物體外抗結(jié)核分枝桿菌活性和人體臨床試驗之間的一個重要橋梁。小鼠最常用于抗結(jié)核藥物體內(nèi)藥效學(xué)評價，其次是豚鼠， 非人靈長類；感染途徑一般包括氣溶膠、氣管、鼻腔、靜脈、腹腔等；分析、評價手段可通過對動物肺、脾進(jìn)行臟器菌落計數(shù)，臟器病理和抗酸染色等方法。

2.1 小鼠

是抗結(jié)核評價使用最廣泛的動物，具有易于操作、價格便宜、所需化合物量少的優(yōu)點。小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、C3HeB/FeJ等，一般可采用氣溶膠霧化感染、滴鼻感染或尾靜脈注射等方法。小鼠結(jié)核病模型不形成干酪樣肺病變和空洞，只形成非壞死性細(xì)胞肉芽腫，主要由淋巴細(xì)胞、上皮樣巨噬細(xì)胞和泡沫巨噬細(xì)胞組成。幾乎所有結(jié)核分枝桿菌都在巨噬細(xì)胞中，因此主要反映化合物的胞內(nèi)抗結(jié)核活性。高劑量感染（肺中定植5000CFU或更高）結(jié)核分枝桿菌的小鼠可以在感染后4～6周死亡，低劑量感染免疫缺陷小鼠（例如無胸腺裸鼠或γ干擾素敲除小鼠）也會產(chǎn)生同樣的結(jié)果。低劑量感染（肺定植10～500CFU）免疫健全小鼠如BALB/c和C57BL/6，獲得性免疫反應(yīng)可以限制感染的進(jìn)展，感染后4周肺荷菌量進(jìn)入平臺期，形成長期存活的慢性感染。

小鼠急性感染模型：模擬人體急性感染狀態(tài)，是在小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)未完全建立，肺中的結(jié)核分枝桿菌活躍生長時，開始藥物治療，評價藥物對增殖期細(xì)菌的抑制/殺滅能力，時間一般在2周內(nèi)。一般可采用氣溶膠霧化感染、滴鼻感染或尾靜脈注射等方法進(jìn)行大劑量結(jié)核分枝桿菌的感染，感染后1～2周開始治療，藥物對復(fù)制期的結(jié)核分枝桿菌治療1～4周。停藥后，安樂處死小鼠，無菌操作下解剖，組織勻漿，10倍稀釋后涂在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行37℃培養(yǎng)和活菌計數(shù)。評價指標(biāo)： 肺、脾的活菌計數(shù)，小鼠存活率，體重變化，組織病理學(xué)檢查等。

小鼠慢性感染模型：慢性模型是模擬人體感染的持留狀態(tài)，在小鼠免疫反應(yīng)已建立，肺中的結(jié)核分枝桿菌緩慢生長或進(jìn)入平臺期時，才開始治療。此模型中具有良好活性的藥物，在臨床治療中有可能縮短療程。慢性感染模型通常使用低劑量菌感染小鼠（30～100CFU/肺），小鼠有充足的免疫反應(yīng)，感染后可存活數(shù)月至1年以上，且肺臟荷菌量不會超過6～6.5 log10CFU。感染結(jié)核分枝桿菌3周后開始治療。在治療相應(yīng)時間后（通常以1個月、2個月治療多見），解剖小鼠，取出肺、脾等組織，研磨均勻后，接種用于CFU計數(shù)。最后統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)，對化合物作出評價。

C3HeB/FeJ小鼠模型：C3HeB/FeJ小鼠在合適的條件下感染結(jié)核分枝桿菌后能形成干酪樣病灶。C3HeB/FeJ小鼠的肺病理存在異質(zhì)性，因此實驗需要小鼠的數(shù)量比BALB/c小鼠數(shù)量多。氣溶膠感染結(jié)核分枝桿菌50～75個CFU后，形成3種典型的肺病灶：爆發(fā)性壞死性肺泡炎、組織有序的干酪樣肉芽腫和細(xì)胞肉芽腫。一般感染5～6周后，可以形成干酪樣壞死。1/3至2/3的小鼠形成結(jié)構(gòu)有序的干酪樣肉芽腫，中間干酪化，周邊纖維化和類似大型種屬包括人的無氧特性。大的干酪樣肉芽腫會隨著感染時間的延長形成空洞病灶，空洞可以通過計算機斷層掃描（CT）發(fā)現(xiàn)。空洞病灶在人感染結(jié)核分枝桿菌后也會形成。該模型可以評價化合物進(jìn)入空洞病灶的殺菌活性。考慮到干酪樣病灶對結(jié)核藥物的PK/PD影響，C3HeB/FeJ小鼠的組織病理學(xué)的改變能較好地用該種小鼠反應(yīng)藥物對患者的活性。

2.2 豚鼠

相對于小鼠，豚鼠對結(jié)核分枝桿菌更易感，通常極少量的活菌（20～30個CFU）的氣溶膠感染就可在豚鼠體內(nèi)形成感染。豚鼠感染后，可在肺部形成典型的肉芽腫結(jié)構(gòu)，且可發(fā)展為干酪樣壞死，其肺部壞死灶、淋巴結(jié)結(jié)核和結(jié)核病的播散情況，使得豚鼠模型可以更好地模擬人類結(jié)核病的特征。但相對于小鼠，豚鼠價格較貴，操作較麻煩，而且豚鼠對結(jié)核分枝桿菌高度易感，具有強抗結(jié)核活性的研究藥物才能在豚鼠模型得到較好的評價。豚鼠模型更多地用于抗結(jié)核活性確證及治療方案的評價，一般較少用于抗結(jié)核新藥的初篩。在近似菌量負(fù)載下，相比于BALB/c小鼠，豚鼠的治療效果更顯著。對于再次確定或修正小鼠體內(nèi)得到的結(jié)果，尤其是缺氧的微環(huán)境模擬，豚鼠是比小鼠更優(yōu)的選擇。在涉及這方面的研究時，需要提供豚鼠模型的結(jié)果。其研究策略包括但不限于如下內(nèi)容：

（1） 選擇無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級4～6周齡豚鼠（Hartley品系），體質(zhì)量為300～350 g；將實驗動物隨機分組，各組動物分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)條件保持恒溫恒濕，并定期通風(fēng)消毒。

（2）利用加入0.05%的Tween 80的7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株至對數(shù)生長期，并利用H37Rv菌株的生長曲線或A570/600測定菌液的濃度。

（3）利用微生物氣溶膠發(fā)生器制備感染物的氣溶膠懸液，以氣溶膠方式感染豚鼠：5×106 CFU/mL的菌懸液，置于霧化器中，氣溶膠裝置感染，感染10天后，可解剖基線豚鼠檢測感染是否成功（肺臟荷菌量達(dá)到103～104/105CFU），3～4周后可開始治療。

（4）根據(jù)實驗設(shè)計，對各治療組使用彎頭灌胃針進(jìn)行灌胃給藥，通常治療4～8周，期間根據(jù)動物體重增長及時調(diào)整藥物劑量。

（5）在預(yù)定的治療結(jié)束時間點解剖豚鼠，取臟器（通常為肺、脾），加入無菌生理鹽水/PBS研磨臟器組織。

（6） 活菌計數(shù)：稀釋度根據(jù)臟器病變程度確定，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取適當(dāng)體積的不同稀釋度菌液，接種于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)，3～4周后進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算每只豚鼠肺臟和脾臟的活菌數(shù)，以對數(shù)形式表示。

（7）比較各組間差異，評價不同化合物或組合方案的效果。評價指標(biāo)包括但不限于：豚鼠體重，臟器重量變化，臟器活菌計數(shù)結(jié)果，病理結(jié)果。

2.3? ? 非人靈長類

主要是犬齒獼猴、恒河獼猴被用于臨床前抗結(jié)核藥物評價。通過支氣管滴入大約25個CFU的結(jié)核分枝桿菌，可以在隨后6～8個月形成近似等比例的活動性結(jié)核病或亞臨床/潛伏感染。正電子斷層掃描顯像（PET-CT）在感染后3周可以鑒定動物是否會發(fā)展為活動性或潛伏結(jié)核。大劑量滴注（1000個CFU）會在較短時間獲得高比例的活動性結(jié)核。活動性結(jié)核病可以通過以下特點鑒別：癥狀例如咳嗽、體重降低等，紅細(xì)胞沉降率升高，胸片異常，胃吸入和支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)陽性。藥物療效評價的治療終點包括胃吸入或支氣管肺泡灌洗液活菌計數(shù)、系列PET-CT成像終點、器官CFU評分和病理學(xué)評分等。獼猴用于臨床前藥效評價面臨許多挑戰(zhàn)，例如不容易獲得，價格非常昂貴，需要特殊的飼養(yǎng)條件和倫理問題等。

3? ? 總結(jié)

綜上，實驗室可根據(jù)自身條件，采用多種不同的小鼠模型用于抗結(jié)核新藥篩選與評價，而不限于采用同一種模型，但一般應(yīng)包括小鼠急性與慢性感染模型。同時，考慮到對結(jié)核感染多方面活性的評估，可以使用不同的結(jié)核分枝桿菌菌株/動物模型，來評價單個藥物/治療方案。實驗室內(nèi)部應(yīng)具備統(tǒng)一、規(guī)范的方案和方法，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)菌株、感染菌量、感染方式、對照藥物以及治療時間等。菌株的選擇，可能是影響頭對頭（head to head）試驗結(jié)果比對的最重要條件。推薦使用不同菌株，如能獲得臨床分離菌株，也可使用。所使用的結(jié)核菌株應(yīng)具有良好的生長狀態(tài)，較少的傳代次數(shù)，毒力保持良好且背景清楚。

評價研究藥物的治療效果，其在聯(lián)合治療方案中的作用，確定研究藥物在臨床試驗中使用的劑量、治療方案等，都可以通過動物模型來進(jìn)行。如果結(jié)核分枝桿菌菌株表現(xiàn)出對某一藥物的敏感性降低，也可以在相應(yīng)的動物模型中評估其是否適合產(chǎn)生和維持臨床上明顯的感染癥狀。通過體外數(shù)據(jù)與動物模型，可推論聯(lián)合試驗方案是否對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他菌株有效。

參 考 文 獻(xiàn)

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基金項目：國家自然科學(xué)基金（No. 82173862）；北京市醫(yī)院管理中心臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項（No. ZYLX202123）

作者簡介：朱慧，女，生于1977年，博士，副研究員，研究方向為抗結(jié)核藥物藥理學(xué)，E-mail： zhuhui06@tsinghua.org.cn