趕黃草水煎液對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

覃俊媛 孫晨 彭成 謝曉芳

摘要：目的 探究趕黃草水煎液在體外對金黃色葡萄球菌（SA）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜（MRSA）形成的影響。方法 采用微量肉湯稀釋法測定趕黃草水煎液對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），根據MIC和MBC繪制殺菌曲線，采用結晶紫染色法和激光共聚焦觀察趕黃草水煎液對SA和MRSA生物膜形成的影響，并通過測定胞外多糖和胞外DNA的含量研究趕黃草水煎液破壞SA和MRSA生物膜的作用方式。結果 趕黃草水煎液對SA的MIC和MBC分別為1.36和2.71 mg/mL，對MRSA的MIC和MBC為2.71和5.73 mg/mL；趕黃草水煎液可使SA和MRSA均生長受到抑制，抑制生物膜的形成、減少胞外多糖和胞外DNA的釋放。結論 趕黃草水煎液對SA和MRSA具有良好的抑菌作用，可通過抑制胞外多糖和DNA的分泌破壞生物膜的形成。

關鍵詞：趕黃草；金黃色葡菌球菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；抗菌；細菌生物膜

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Abstract Objective To explore the effects of Penthorum chinense Pursh decoction on the biofilm of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro. Methods The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus were determined by the micro broth dilution method， and the bactericidal curve was drawn according to MIC and MBC. The effects of Penthorum chinense Pursh decoction on the biofilm formation of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus were observed by crystal violet staining and laser confocal technique. By measuring the content of extracellular polysaccharide and extracellular DNA， the mechanism of its action on destroying biofilm of Staphylococcus aureus （SA） and methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） was studied. Results The MIC and MBC of SA were 1.36 mg/mL and 2.71 mg/mL， and the MIC and MBC of MRSA were 2.71 and 5.73 mg/mL， respectively; under the action of Penthorum chinense Pursh decoction， the growth of SA and MRSA was inhibited. The results of crystal violet staining showed that the area of the bacterial biofilm was decreased under the action of Penthorum chinense Pursh decoction. Similarly， Penthorum chinense Pursh decoction could destroy the formation of bacterial biofilm of SA and MRSA through laser confocal observation. Moreover， it reduced the release of extracellular polysaccharides and extracellular DNA. Conclusion The Penthorum chinense Pursh decoction has? remarkable antibacterial effects on Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus， and destroys the formation of biofilm by reducing the secretion of extracellular polysaccharide and DNA.

Key words Penthorum chinense Pursh; Staphylococcus aureus; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Antibacterial; Bacterial biofilm

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ，SA）是一種條件性致病的革蘭陽性菌，可引起心包炎、腦膜炎、敗血癥和膿毒血癥等感染性疾病[1]。在抗生素被發現之前，金黃色葡萄球菌菌血癥患者的死亡率超過80%[2]。20世紀40年代初青霉素被發現，隨著青霉素的應用，極大改善了治療感染的困境；1960年，英國一家醫院首次分離出青霉素耐藥菌株[2]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）成為了一個世界性的難題，它幾乎對所有可用的β-內酰胺類藥物產生了耐藥性。萬古霉素曾被認為是治療嚴重MRSA感染的最后選擇之一[3]，然而近年來發現MRSA的耐藥性包括萬古霉素以及相對較新的藥物，如利奈唑胺和達托霉素[4-5]。MRSA 還可獲得對多種替代抗菌藥物的耐藥性，使感染的治療更加復雜[6]。自21世紀以來，中國SA的耐藥性逐年上升，MRSA在醫院和社區檢出率較高，在健康的人群中MRSA攜帶率達21.2%[7-8]。有報道稱在371名金黃色葡萄球菌菌血癥患者中，MRSA占社區發病病例的42.2%和醫院發病病例的74.5%，給治療帶來比較大的困難[9]。面對耐藥率持續不斷上升，而新抗生素的研發大幅度下降的情形，亟需尋找新抗菌劑或新方法來解決上述問題。

在中國傳統醫學中，中藥及蒙藥、藏藥和苗藥等少數民族藥有悠久的臨床應用歷史，在治療細菌性感染疾病中有著優勢。趕黃草為虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜（Penthorum chinense Pursh）的地上部分，是苗族民間習用藥，現收錄于《四川省中藥材標準》（2010年版）和《湖南省中藥材標準》（2009年版）[10]；在傳統上常用來治療黃疸、肝炎、水腫等。由趕黃草制成的中成藥肝蘇顆粒，有降酶、保肝、退黃、健脾功效，在臨床用于治療多種肝炎，包括乙型肝炎、急性病毒性肝炎[11]。趕黃草主要成分是槲皮素、槲皮苷、喬松素、東莨菪素和趕黃草苷等[12]。現代藥理研究表明，趕黃草具有保肝、抗脂肪肝、抗肝纖維化和抗乙肝病毒等作用[11，13-14]。也有文獻報道趕黃草水煎液及提取物可以在體外抑制金黃色葡萄球菌的生長[15-17]。然而關于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球活性研究暫未見報道。因此本研究針對當前細菌耐藥性的難題，采用體外抗菌實驗方法，評價趕黃草水煎液對SA、MRSA的抗菌活性，并從細菌生物膜方面研究其可能的機制，為趕黃草抗菌活性的明確和相關藥物開發提供基礎依據。

1 材料和儀器

1.1 材料和試劑

趕黃草，購自四川省瀘州市古藺縣古家趕黃草種植合作社，經成都中醫藥大學高繼海副教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬扯根菜；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26001]購自中國食品藥品檢定研究院，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CCTCC AB 2015112）購自中國典型培養物保藏中心；MHB培養基（Oxoid公司，批號：2963434）；MHA培養基（Oxoid公司，批號：2487022）；營養瓊脂培養（北京奧博星生物技術有限公司，批號：20200602）；氯化三苯四氮唑（TTC）（Sigma-Aldrich公司，批號：BCCB1241）；1%結晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200821）；SYTO9（Thermo Fisher Scientific，批號：2266591）；D（+）-無水葡萄糖（北京索萊寶科技有限公司，批號：1122A0229）；苯酚（成都市科隆化學品有限公司，批號：2021071201）等。

1.2 試驗器材

DH124L電熱恒溫培養箱；IS-4恒溫振蕩培養箱；AL104 電子天平；Cytation 5細胞成像微板檢測系統；LEGEND MICRO 21R離心機； FV-1200激光共焦顯微鏡。

2 方法

2.1 趕黃草水煎液制備

取趕黃草100 g，切碎，加水煎煮3次。第一次加10倍量的水，浸泡30 min，第二、三次加8倍量的水，每次煎煮2 h。每次濾過取水煎液，將3次煎液合并，濃縮到含生藥1.39 g/mL。以108℃，2 min高壓滅菌，冷卻后放置-20℃培養。使用前用純水稀釋成173.75 mg/mL。

2.2 菌液配制

所有菌株都在營養瓊脂平皿上35℃隔夜培養。使用前，挑取適量菌落用生理鹽水調整濃度成0.5麥氏（1.5×108 CFU/mL），用MHB培養基稀釋30倍，最終菌液濃度為5 ×106 CFU/mL。

2.3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

根據臨床和實驗室標準協會（CLSI2020版）的肉湯微量稀釋法，使用96孔微板進行試驗。96孔板除四周孔每孔加入100 μL MHB 培養基，于第2列每孔加入100 μL 173.75 mg/mL趕黃草水煎液，混勻，二倍稀釋至第9列。第10列為空白對照，第11列為陰性對照。第2列到第10列每孔再加入100 μL菌液，第11列加入同等體積的培養基。培養24 h后，每孔加入0.25%TTC，孵育30 min，肉眼直接觀察，變紅色孔代表有菌，未變紅的最低濃度孔判定為MIC。吸取上清液100 μL 接種至MHA平皿，培養24 h，長出菌落小于5個判定為MBC，實驗重復3次。

2.4 殺菌曲線的繪制

移取SA和MRSA菌液于12孔板中，并向其加入不同濃度的趕黃草水煎液，使其最終濃度為2×MIC、1×MIC、1/2MIC、1/4MIC，選擇不含藥的菌液為空白組對照組，在35℃、120 r/min條件下處理24 h。分別在孵育0、4、8、16和24 h測定各組細菌數。每組設3個重復，實驗重復3次。

2.5 趕黃草水煎液對SA和MRSA生物膜的影響

2.5.1 結晶紫半定量黏附實驗

96孔板中分別接種200 ?LSA和MRSA菌液，35℃靜置培養48 h后，清洗除去培養基和浮游菌，然后分別加入相對應的2MIC、MIC、1/2MIC，同時以不含趕黃草水煎液的孔作為空白對照，于 35℃孵育24 h。棄孔板中上清液，清洗3次，自然晾干之后每孔加入150 ?L甲醇固定15 min，去掉甲醇自然晾干，加入150 ?L 0.1%結晶紫染色15 mim，用自來水清洗，自然干燥，加入150 ?L 95%乙醇，37℃溶解30 min，用酶標儀在590 nm波長處測量各孔的吸光度。

2.5.2 激光共聚焦顯微鏡觀察趕黃草水煎液對細菌生物膜的破壞

每個共聚焦培養皿中加入2 mL 菌液，35℃靜置培養72 h。棄上清液，清洗3次，加入不同濃度的趕黃草水煎液作用8 h，以空白培養基作為對照。棄去液體，洗凈，加入1 ?L SYTO9染色液，孵育20 min。除去染料，用激光共聚焦顯微鏡掃描。

2.6 趕黃草水煎液對SA和MRSA胞外多聚物的作用

2.6.1 趕黃草水煎液對SA 和MRSA胞外多糖的影響

參照Li等[18]的方法，將不同濃度的趕黃草水煎液加入含菌培養基中，終濃度為1×MIC、1/2MIC、1/4MIC，選擇不含藥菌液為空白對照組，在35℃、120 r/min條件下處理24 h。培養結束后，取 1mL離心10 min （12000 g，4℃），取上清液用濾膜（0.22 μm）過濾，加入3 mL預冷的乙醇，置于4℃冰箱過夜。次日，以15000 r/min、4℃離心10 min，棄去上清液，加入1 mL的去離子水以溶解多糖。胞外多糖含量的測定按照苯酚硫酸法于490 nm處進行測定，并同時采用葡萄糖作為標準物，測得標準曲線的方程為y=0.10756+4.45949x （R2=0. 0.9968）。

2.6.2 趕黃草水煎液對SA和MRSA胞外DNA的影響

參照Xie等[19]的方法，將不同濃度的趕黃草水煎液加入到含菌培養基中，終濃度為1×MIC、1/2MIC、1/4MIC，選擇不含藥的菌液為空白組對照組，在35℃、120 r/min條件下處理24 h。培養結束后，在孔板每孔加入20 μL 0.5 mol/L的EDTA放入4℃冷卻1 h。棄去上清液，每孔加入700 μL?50 mmol/L 的TEN緩沖液進行吹打。在液體放入4℃預冷的離心管，離心5 min（18000 r/min，4℃）。取上清液，加入300 μL TE緩沖液和相同體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1，V/V/V）混合液，渦旋萃取。離心10 min（12000 r/min，4℃），取上清液，加入相同體積的氯仿：異戊醇（24：1，V/V）混合液，渦旋萃取，離心10 min（12000 r/min，4℃）。取上層水相，加入3倍體積預冷的無水乙醇，加入1/10 3 mol/L醋酸鈉，混合均勻，放入-20℃過夜。次日，離心20 min（18000 r/min，4℃），棄去上清液加入預冷的乙醇重懸，晾干。加入30 μL TE 緩沖液，充分溶解沉淀，用酶標儀檢測，胞外DNA 的相對表達量用A600表示。

3結果

3.1 趕黃草水煎液的抗菌活性

培養24 h后，根據TTC顯色結果，得到趕黃草水煎液對SA和MRSA的MIC值如下圖1A顯示。上清液涂布平皿結果顯示，趕黃草水煎液對SA的MBC值為2.71 mg/mL，MRSA的MBC為5.43 mg/mL。表明趕黃草水煎液具有抗SA和MRSA活性。

3.3 趕黃草水煎液對SA和MRSA生長曲線的影響

由圖2可知，當趕黃草水煎液質量濃度為0時，兩株細菌的生長未受到影響。當趕黃草水煎液質量濃度為0.34 mg/mL時，SA的生長趨勢與空白組相似。當趕黃草水煎液質量濃度為0.68和1.36 mg/mL時，SA活菌數變化顯著（P<0.05或P<0.01），說明趕黃草水煎液對SA的作用表現為抑菌方式。當趕黃草水煎液質量濃度增加到2.71 mg/mL時，SA活菌數顯著降低（P<0.05或P<0.01），且在藥物處理16 h后細菌數量下降至4 CFU/mL，殺菌效果大于99.9%，說明2.71 mg/mL濃度趕黃草水煎液對SA表現為殺菌作用。結果詳見圖2A。

當趕黃草水煎液質量濃度為0.68和1.36 mg/mL時，MRSA的生長趨勢與空白組相似。當趕黃草水煎液質量濃度為2.71 mg/mL，MRSA活菌數變化顯著（P<0.05或P<0.01），說明趕黃草水煎液對MRSA的作用表現為抑菌方式。當趕黃草水煎液質量濃度增加到5.43 mg/mL時，MRSA活菌數顯著降低（P<0.05或P<0.01），且在藥物處理24 h后細菌數量下降至1 CFU/mL，殺菌效果大于99.9%，說明5.43 mg/mL濃度趕黃草水煎液對MRSA表現為殺菌作用。結果詳見圖2B。結果表明趕黃草水煎液對SA和MRSA的抑制作用呈濃度相關性。

3.3 結晶紫半定量法測定趕黃草水煎液的抗生物膜效果

由圖3可見，96孔板內細菌生物膜面積與藥物濃度呈相關性。3個濃度趕黃草水煎液對SA的形成均有抑制作用（P<0.01或P<0.001），其中1.36 mg/mL的抑制作用最強（P<0.001）。趕黃草水煎液對MRSA形成有抑制作用趨勢。

3.4 激光共聚焦顯微鏡觀察趕黃草水煎液對細菌生物膜的破壞

SYTO 9是一種綠色熒光核酸染色劑，染色程度可以反映生物膜結構的稀疏，因此常用于觀察藥物對細菌生物膜的作用[20]。圖4、5顯示，隨著趕黃草水煎液濃度的增加，有大量不能被SYTO 9著色區域，細菌分布稀疏，代表生物膜結構變松散，表明趕黃草水煎液以劑量依賴性方式抑制SA 和MRSA細菌生物膜的形成。

3.5 趕黃草水煎液對SA 和MRSA胞外多糖和DNA含量的影響

胞外多糖和DNA是細菌生物膜中的主要成分，是生物膜形成的關鍵[21-23]。由圖6A可知，趕黃草水煎液對SA胞外多糖分泌的抑制作用具有濃度依賴性，3個濃度均能顯著減少胞外多糖的分泌（P<0.01）。而趕黃草水煎液3個濃度均能明顯降低MRSA胞外多糖的分泌（P<0.05或P<0.01），但未呈劑量相關性，詳見圖6B。在胞外DNA釋放方面，趕黃草水煎均能顯著降低胞外DNA釋放（P<0.05或P<0.01），兩個菌株均呈濃度相關性，詳見圖7。

4 討論

細菌生物膜是一種具有三維結構的細菌細胞群，黏附在非生物或生物表面上[24]。細菌分泌的蛋白質、胞外多糖、胞外DNA和脂質組成細胞外基質（EPS），為細菌生物膜提供機械穩定性，介導它們與惰性材料表面的粘附，其相互作用并固定細菌，將其包裹在黏性基質內以應對極端環境，抵抗抗生素和宿主免疫反應[25-26]。可見，細菌生物膜的存在提高了細菌對抗菌藥物的耐藥性，有研究發現生物膜內細菌的耐藥性是浮游菌的10～1000倍[27-28]。生物膜形成耐藥性的機制是多方面，至少包括滲透限制、抗生素外泵系統、耐藥基因的傳播、營養限制及生物膜表型等[29]。生物膜在SA產生耐藥性中具有重要的作用[30]，臨床分離的MRSA菌株絕大多數具有生物膜[31]。因此，生物膜常作為藥物抗菌作用的重要研究靶點之一。

SA分泌多種毒素和毒力因子如中毒性休克毒素-1 、凝集因子A、細菌生物膜，誘發多種感染[32]。隨著抗生素的廣泛應用，SA出現了對多種抗生素的耐藥，包括β-內酰胺類抗生素、萬古霉素、達托霉素、四環素類、氨基糖苷類等[33]。其對β-內酰胺類抗生素耐藥性與青霉素結合蛋白（PBPs）結構的改變相關[33]。PBPs蛋白位于細菌細胞壁上，負責合成細胞壁過程中的轉糖基化和轉肽化，是β-內酰胺類抗生素作用的靶點，研究表明MRSA可以特異性改變PBPs蛋白的結構[34]。Hartman和Tomasz發現MRSA菌株和敏感菌株的主要差異是存在一種名為PBP2a蛋白，是一種具有轉肽酶區、跨膜區和非青霉素結合區的細長蛋白，具有變構位點，它的活性部位較難被β-內酰胺類藥物所接近，因此抗生素不會影響MRSA細胞壁肽聚糖的合成[35-37]。PBP2a蛋白的編碼基因位于MRSA葡萄球菌染色體mec盒分型（SCCmec）上的mecA基因，因此mecA基因存在可增強MRSA的耐藥性[38]。在本研究中，對趕黃草水煎液抗SA和MRSA活性進行了評估，并且在較低的濃度（1.36和2.71 mg/mL）下顯示抑菌作用，最低殺菌濃度為2.71和5.43 mg/mL。動態殺菌曲線顯示，趕黃草水煎液對SA和MRSA的生長具有抑制作用并呈濃度依賴性。結晶紫染色和激光共聚焦顯微鏡結果顯示，隨著趕黃草濃度的升高，結晶紫染色面積變小，表示細菌數量減少和生物膜結構的松散，提示趕黃草可破壞SA和MRSA生物膜。進一步通過檢測生物膜形成關鍵因子胞外多糖和DNA，顯示趕黃草水煎液可抑制SA和MRSA胞外多糖和DNA的釋放，且對胞外DNA的合成抑制呈良好的量效正相關。以上研究結果表明，趕黃草水煎液對SA和MRSA具有殺菌作用，機制可能與其抑制生物膜的形成相關，研究結果為其抗菌作用的開發提供理論依據，也為從苗藥等民族藥物中發現新抗菌藥物提供一種思路。然而，本研究對趕黃草的殺菌機制還需進一步研究，如藥物是否改變細菌膜的通透性和細菌的形態和結構、是否抑制耐藥蛋白的表達、是否改變細菌能量代謝或抑制相關酶的活性和基因表達等。

參 考 文 獻

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基金項目：國家科技部重大新藥創制任務（No. 2019ZX09721001-008）

作者簡介：覃俊媛，女，生于1995年，在讀碩士研究生，研究方向為中藥藥理，E-mail： junyuanqin@qq.com