注射用頭孢呋辛鈉中降解雜質(zhì)的研究

譚勝連 周從鷹 張旭途 劉佳

摘要：目的 對(duì)注射用頭孢呋辛鈉中4個(gè)未公開報(bào)道的降解雜質(zhì)進(jìn)行研究，并推導(dǎo)其化合物結(jié)構(gòu)。方法 采用YMC C8色譜柱（4.6 mm×50 mm， 3 μm）；以0.005 mol/L醋酸銨溶液-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.5 mL/min。離子源：電噴霧離子（ESI）源。結(jié)果 注射用頭孢呋辛鈉中4個(gè)未知雜質(zhì)得到有效分離，使用Q EXACTIVE高分辨質(zhì)譜確定了雜質(zhì)的分子量，并依據(jù)頭孢類化合物的裂解及降解理論推測(cè)出其結(jié)構(gòu)與形成機(jī)理，與頭孢類已知雜質(zhì)相異，雜質(zhì)Ⅳ為本品特有的氨降解雜質(zhì)。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可用于評(píng)價(jià)注射用頭孢呋辛鈉中的未知雜質(zhì)，同時(shí)，研究結(jié)果為注射用頭孢呋辛鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂和質(zhì)量控制提供了重要的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：LC-MS/MS；頭孢呋辛；降解雜質(zhì)

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract Objective Research of four degradation impurities in cefuroxime sodium for injection which have not been reported publicly， and speculate their structures. Methods Chromatographic separation was performed on a YMC C8 column （4.6 mm×50 mm， 3 μm）. The mobile phase consisted of 0.005 mol/L ammonium acetate solution-acetonitrile with the linear gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min. The detection was ESI in the positive mode. Results Four unknown products were effectively separated. The molecular weight of the impurities were exactly determined by Q EXACTIVE HRMS. The structures and the generation mechanism of the four products were preliminarily confirmed according to the cracking and degradation theory of cephalosporins. Unlike normal impurities in cephalosporin， impurity IV is the special ammonia degradation impurity of this product. Conclusion The established LC-MS/MS method is simple and sensitive， and can be used to evaluate unknown impurities in cefuroxime sodium for injection. At the same time， the research results provide an important reference for the quality standards and quality control of cefuroxime sodium for injection.

Key words LC-MS/MS; Cefuroxime; Degradation impurities

我國(guó)為藥品生產(chǎn)與使用大國(guó)，藥品的質(zhì)量及安全情況不僅是監(jiān)管機(jī)構(gòu)和藥企的重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域，也是人民群眾普遍關(guān)心的熱點(diǎn)問(wèn)題。藥品質(zhì)量的優(yōu)劣與臨床用藥的不良反應(yīng)息息相關(guān)，而對(duì)藥品中雜質(zhì)的控制更是保證藥品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

頭孢呋辛鈉由英國(guó)葛蘭素公司研發(fā)，屬于第二代半合成頭孢菌素抗生素，在體外具有出色的活性，對(duì)腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)，并且具有良好的藥動(dòng)學(xué)特性，可用于對(duì)頭孢呋辛敏感的細(xì)菌引起的呼吸道感染、耳鼻喉科感染、泌尿道感染、皮膚和軟組織感染等，且可用于術(shù)前或術(shù)中防止敏感致病菌的生長(zhǎng)，減少術(shù)中及術(shù)后因污染引起的感染[1-2]。現(xiàn)階段，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS）在藥物的雜質(zhì)研究中已得到廣泛的應(yīng)用，尤其是多級(jí)質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜更是近年研究的熱點(diǎn)技術(shù)。研究通過(guò)質(zhì)譜信息確定化合物的分子量進(jìn)而推測(cè)出其可能的分子結(jié)構(gòu)[3-4]。在質(zhì)譜裂解規(guī)律分析中，β-內(nèi)酰胺類抗生素共有的裂解反應(yīng)是β-內(nèi)酰胺環(huán)開裂，3位碳上的側(cè)鏈斷裂等[5]。

目前，對(duì)注射用頭孢呋辛鈉的雜質(zhì)研究大多集中在現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的已知雜質(zhì)或頭孢菌素的常見降解雜質(zhì)，而對(duì)其他降解雜質(zhì)的研究筆者則未見報(bào)道。在注射用頭孢呋辛鈉一致性評(píng)價(jià)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)4個(gè)未知降解雜質(zhì)，本文分別對(duì)其命名為雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ。4個(gè)雜質(zhì)在參比制劑及自研產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究過(guò)程中略有增長(zhǎng)。本研究通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法對(duì)葛蘭素公司及本廠的注射用頭孢呋辛鈉中4個(gè)未知降解雜質(zhì)進(jìn)行分析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及生成機(jī)理進(jìn)行推導(dǎo)。旨在為注射用頭孢呋辛鈉產(chǎn)品中的雜質(zhì)控制及質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

注射用頭孢呋辛鈉（規(guī)格0.25 g，批號(hào)2G9F）購(gòu)自Glaso UK公司；注射用頭孢呋辛鈉（規(guī)格1.5 g，批號(hào)190002）來(lái)自廣州白云山天心制藥股份有限公司。色譜級(jí)乙腈購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；分析級(jí)冰醋酸購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；分析級(jí)醋酸鈉、醋酸銨和磷酸購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；超純水由Millipore純水儀制備。

1.2 儀器

Q EXACTIVE型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）；UltiMate 3000 UHPLC液相色譜儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司），包括UltiMate 3000泵、UltiMate 3000二極管陣列檢測(cè)器、UltiMate 3000自動(dòng)進(jìn)樣器；工作站：Thermo Xcalibur Qual Browser；分析天平AB-135S（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 LC-MS/MS系統(tǒng)條件

色譜柱：YMC C8（4.6 mm×50 mm， 3 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min ；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相A：0.005 mol/L醋酸銨鹽緩沖液（取0.38 g醋酸銨，加水溶解并稀釋成1000 mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.4）；流動(dòng)相B：乙腈，按表1梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子化方式ESI（+），ddMS2；一級(jí)分辨率70000；二級(jí)分辨率17500；數(shù)據(jù)采集范圍 120～1800 m/z；噴霧電壓：3.8 kV；噴霧溫度280℃，離子傳輸管溫度320℃，鞘氣壓力60 arb；輔助氣壓力10 arb；S-lens RF level：50；二級(jí)碰撞能量：nce 15 40 60。

1.3.2 供試品溶液的配制

取注射用頭孢呋辛鈉適量，加水溶解并稀釋制成0.5 mg/mL的溶液。

2 結(jié)果

2.1 兩廠家的雜質(zhì)譜對(duì)比

參比制劑與自研制劑的雜質(zhì)個(gè)數(shù)均為11個(gè)，自研制劑的各未知雜質(zhì)的含量均小于0.1%，參比制劑雜質(zhì)量稍高，其中雜質(zhì)I接近0.15%，色譜圖見圖1。在一致性評(píng)價(jià)過(guò)程中，雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ為未知降解產(chǎn)物，在留樣過(guò)程中有增加趨勢(shì)，需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ的結(jié)構(gòu)推測(cè)

2.2.1 雜質(zhì)I的結(jié)構(gòu)推測(cè)

參考《中國(guó)藥典》青霉素鈉雜質(zhì)D結(jié)構(gòu)及文獻(xiàn)資料[6-9]。推測(cè)其為頭孢呋辛去氨基甲酰基異構(gòu)化后形成的雜質(zhì)，見圖2。m/z 382為[M+H]+離子峰，m/z 338、m/z 320、m/z 124、m/z 112、m/z 94均為二級(jí)離子峰，見圖3～4。

2.2.2 雜質(zhì)Ⅱ的結(jié)構(gòu)推測(cè)

參考《美國(guó)藥典》頭孢地尼雜質(zhì)b結(jié)構(gòu)及頭孢唑林雜質(zhì)b結(jié)構(gòu)，頭孢類易形成雙羥基結(jié)構(gòu)的降解產(chǎn)物[10-15]。根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜的碎片離子峰推測(cè)，m/z 267為[M1+K]+離子峰，m/z 249為[M2+K]+離子峰，m/z 211為[M2+H]+離子峰。m/z 124和m/z 94均為m/z 211的二級(jí)離子峰。推測(cè)雜質(zhì)Ⅱ?yàn)镸1與M2。為水合醛與醛的互變體。見圖5～7。M1的雜質(zhì)量較低未能獲取二級(jí)質(zhì)譜。

2.2.3 雜質(zhì)Ⅲ的結(jié)構(gòu)推測(cè)

根據(jù)雜質(zhì)Ⅲ的一級(jí)質(zhì)譜m/z 364為[M+H]+離子峰， m/z 336、m/z 318、m/z 211、m/z 179、m/z 165、m/z 137、m/z 124、m/z 94均為二級(jí)離子峰。雜質(zhì)Ⅲ與雜質(zhì)I的分子量相差18，推測(cè)雜質(zhì)Ⅲ為雜質(zhì)I的內(nèi)酯。見圖8～10。

2.2.4 雜質(zhì)Ⅳ的結(jié)構(gòu)推測(cè)

根據(jù)雜質(zhì)Ⅳ的一級(jí)質(zhì)譜m/z 419為[M+K]+離子峰，m/z 381為[M+H]+離子峰，m/z 364、m/z 239、m/z 193、m/z 149、m/z 94均為二級(jí)離子峰。結(jié)合頭孢呋辛雜質(zhì)降解規(guī)律，推測(cè)其為去氨甲酰頭孢呋辛的酰胺化物，見圖11～13。

2.2.5 測(cè)定結(jié)果

高分辨質(zhì)譜所測(cè)定的4個(gè)雜質(zhì)的質(zhì)荷比與推測(cè)結(jié)構(gòu)的質(zhì)荷比理論值相當(dāng)，見表2。

2.3 雜質(zhì)的形成機(jī)理推測(cè)

頭孢呋辛（圖14）雜質(zhì)I、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ的形成機(jī)理見圖15。

參考青霉素鈉雜質(zhì)D的形成機(jī)理[16]，頭孢呋辛的β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)，5位N對(duì)質(zhì)子化的酰胺羰基（16位C）進(jìn)行親核取代，成五元環(huán)，所得的醇胺脫水形成雜質(zhì)I。雜質(zhì)I脫水，成五元環(huán)內(nèi)酯，形成雜質(zhì)Ⅲ。

頭孢呋辛的β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)，脫羧，6位鍵水解斷裂，形成雜質(zhì)Ⅱ（M1/M2）。M1與M2為水合醛與醛的互變體。

頭孢呋辛9位C上的氨基甲酸酯水解，形成氨基甲酸，氨基甲酸不穩(wěn)定，進(jìn)一步分解為氨，氨與頭孢呋辛鈉中的雜質(zhì)頭孢呋辛內(nèi)酯發(fā)生氨解反應(yīng)，形成雜質(zhì)Ⅳ。

3 討論

《中國(guó)藥典》2020年版和《英國(guó)藥典》2021年版中注射用頭孢呋辛鈉項(xiàng)下均收載有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，流動(dòng)相同為醋酸鈉-冰醋酸緩沖體系。與《英國(guó)藥典》等度洗脫相比，《中國(guó)藥典》的梯度洗脫法能檢出更多雜質(zhì)。然而，含有不揮發(fā)性鹽的流動(dòng)相嚴(yán)格限制其與質(zhì)譜的聯(lián)用，需對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行調(diào)整，以可揮發(fā)的醋酸銨替代醋酸鈉。

近年來(lái)，采用二維色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行雜質(zhì)研究的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用[17]。其原理是在含不揮發(fā)性鹽流動(dòng)相的一維色譜上收集特定時(shí)段的餾分（雜質(zhì)峰），經(jīng)閥切換技術(shù)導(dǎo)入第二維色譜脫鹽處理，把含不揮發(fā)性鹽的流動(dòng)相置換成適合質(zhì)譜使用的流動(dòng)相并與質(zhì)譜聯(lián)用。該方法優(yōu)勢(shì)明顯，但背后仍存在限制。如，面對(duì)多組分樣品，難以一次連貫分析所有成分，畢竟閥切換及二維洗脫需要時(shí)間。而洗脫時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致一些含量少，穩(wěn)定性差的雜質(zhì)發(fā)生降解，靈敏度下降。故本研究采用傳統(tǒng)方法對(duì)注射用頭孢呋辛鈉的雜質(zhì)進(jìn)行研究。即參考《中國(guó)藥典》方法并優(yōu)化使其兼容質(zhì)譜，聯(lián)合雜質(zhì)峰的洗脫順序及雜質(zhì)量總體分析。

根據(jù)EMA的Guideline on setting specifications for related impurities in antibiotics （EMA/CHMP/CVMP/ QWP/199250/2009），半合成抗生素制劑的鑒定限為0.20%。研究注射用頭孢呋辛鈉在穩(wěn)定性放置過(guò)程中的變化，發(fā)現(xiàn)4個(gè)未知降解雜質(zhì)均有增加趨勢(shì)，為完善注射用頭孢呋辛鈉的評(píng)價(jià)，對(duì)其進(jìn)行探索性研究。本文所述的LC-MS/MS分析方法操作簡(jiǎn)便，能有效鑒定含量約0.01%～0.1%的未知雜質(zhì)，滿足研究需求。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)注射用頭孢呋辛鈉中4個(gè)未知降解雜質(zhì)進(jìn)行分析，推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)及生成機(jī)理，可為注射用頭孢呋辛鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和質(zhì)量控制提供一定的借鑒意義。

參 考 文 獻(xiàn)

Wozniak T J， Hicks J R. Analytical profile of cefuroxime sodium[J]. Anal Profiles Drug Subst， 1991， 20： 209-236.

黃瑩， 楊儀雪， 王葉茹. 注射用頭孢呋辛鈉質(zhì)量統(tǒng)計(jì)分析[C]. 中國(guó)藥學(xué)會(huì)第四屆藥物檢測(cè)質(zhì)量管理學(xué)術(shù)研討會(huì)， 2017： 124-128.

李宏亮， 閔巍， 鄭磊， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定尿中14種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2021， 28（10）： 1194-1197.

陳志謙， 鐘昌平， 陸齊泉， 等. 高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法鑒定頭孢他啶原料藥的有關(guān)物質(zhì)[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2021， 41（12）： 1219-1228.

朱峰， 楊貴方， 楊波， 等. 基于LCMS-IT-TOF技術(shù)分析注射用頭孢美唑鈉有關(guān)物質(zhì)及其質(zhì)譜裂解規(guī)律[J]. 中國(guó)處方藥， 2019， 17（8）： 1-4.

國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[S].（2020年版二部）. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2020： 734.

Liu C， Hai W， Jiang Y， et al. Rapid and simultaneous determination of amoxicillin， penicillin G， and their major metabolites in bovine milk by ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B， 2011， 879（7-8）： 533-540.

Blaha J M， Knevel A M， Kessler D P， et al. Kinetic analysis of penicillin degradation in acidic media[J]. J Pharm Sci， 1976， 65（8）： 1165-1170.

McCarrick T A， McLafferty F W. Penicillin hydrolysis： A kinetic study of a multistep， multiproduct reaction[J]. J Chem Educ， 1984， 61（5）： 463-464.

美國(guó)藥典委員會(huì). 美國(guó)藥典（第43版）[S]. 國(guó)家處方集， 2020： 827.

美國(guó)藥典委員會(huì). 美國(guó)藥典（第43版）[S]. 國(guó)家處方集， 2020： 822.

Okamoto Y， Itoh K， Namiki Y， et al. Method development for the determination of cefdinir and its related substances by high performance liquid chromatography[J]. J Pharm Biomed Anal， 1996， 14（6）： 739-748.

Okamoto Y， Kiriyama K， Namiki Y， et al. Degradation kinetics and isomerization of cefdinir， a new oral cephalosporin， in aqueous solution. 1[J]. J Pharm Sci， 1996， 85（9）： 976-983.

Nishino I， Fujitomo H， Umeda T. Determination of a new oral cephalosporin， cefmatilen hydrochloride hydrate， and its seven metabolites in human and animal plasma and urine by coupled systems of ion-exchange and reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr B， 2000， 749（1）： 101-110.

Sivakumar B， Parthasarathy K， Murugan R， et al. Isolation and characterisation of degradation impurities in the cefazolin sodium drug substance[J]. Sci Pharm， 2013， 81（4）： 933-950.

Kessler D P， Cushman M， Ghebre-Sellassie I， et al. Investigation of a proposed penicillin G acidic degradation scheme using high pressure liquid chromatography and optimization techniques and mechanistic considerations[J]. J Chem Soc Perkin Trans 2， 1983， 15： 1699-1703.

劉洪祥， 王靜， 曹曉云， 等. 二維超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定注射用頭孢替唑鈉的雜質(zhì)譜[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜， 2019，? 50（5）： 559-564.

作者簡(jiǎn)介：譚勝連，男，生于1964年，碩士，高級(jí)工程師，主要從事化學(xué)藥開發(fā)工作，E-mail： TSL801@163.com