CHPF2在膠質瘤中的表達及預后意義

馬原浩 趙宗仁 陳中俊 季歡歡 李靖 劉宇 鄭金玉

【摘要】 目的 采用生物信息技術分析軟骨素聚合因子2（CHPF2）在膠質瘤中的預后意義，并通過實驗進一步驗證其在正常和膠質瘤細胞中的表達情況。方法 首先在GEPIA和HPA數據庫對CHPF2在膠質瘤和正常細胞的表達水平進行分析，隨后在癌癥基因組圖譜（TCGA）和中國腦膠質瘤基因組圖譜（CGGA）下載基因表達和臨床信息文件對CHPF2在膠質瘤中的表達、預后、功能注釋、免疫浸潤和免疫檢查點等情況作進一步闡明。最后采用蛋白質印跡（Western Blot，WB）技術分析了CHPF2在正常和膠質瘤組織中的表達水平。結果 CHPF2在膠質瘤中的表達量高于正常組織，且隨著腫瘤等級的升高而增加。除性別、放療和腫瘤再發情況外，年齡、化療、腫瘤復發、IDH、1p/19q及MGMT等在CHPF2高低表達組中均具有統計學差異。CHPF2較一些常見預后標志物（如TP53、MKI67及EGFR等）對膠質瘤患者生存具有更好的預測性能，可以作為一個獨立的預后因素，并通過對TCGA和CGGA數據庫的獨立預后分析結果進行綜合的Meta分析作進一步驗證。通過GO、KEGG和GSEA方法，對CHPF2可能富集到的通路進行研究。采用TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三種方法，對CHPF2高低風險組中的免疫浸潤情況進行分析，并在最后對CHPF2在免疫檢查點的情況進行了分析。為了進一步驗證可靠性，本研究通過WB技術證實了CHPF2在膠質瘤細胞的表達量較正常細胞中高。結論 CHPF2能夠影響膠質瘤的發生、發展和預后，可以作為膠質瘤患者預后的生物標志物。

【關鍵詞】 膠質瘤；CHPF2；生物信息學；免疫；預后

【中圖分類號】 R739.41 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0163-10

Abstract： Objective The prognostic significance of chondroitin polymerization factor 2（CHPF2） in glioma was analyzed by bioinformatics technology， and its expression in normal and glioma cells was further verified by experiments. Methods The expression levels of CHPF2 in glioma and normal cells were first analyzed in the GEPIA and HPA databases， followed by downloading gene expression and clinical information files from The Cancer Genome Atlas（TCGA） and The Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA） to further elucidate the expression， prognosis， functional annotation， immune infiltration， and immune checkpoints of CHPF2 in glioma. Finally， the expression levels of CHPF2 in normal and glioma tissues were determined using the Western blotting approach. Results CHPF2 expression in gliomas was greater than in normal tissues， and it increased with tumor grade. Except for gender， radiation， and tumor recurrence， the high and low CHPF2 expression groups differed statistically in age， chemotherapy， tumor recurrence， IDH， 1p/19q， and MGMT. CHPF2 outperforms certain popular prognostic markers（e.g. TP53， MKI67， and EGFR） in predicting glioma patient survival and may be utilized as an independent prognostic factor. A complete meta-analysis of the outcomes of separate prognostic analysis of the TCGA and CGGA databases corroborated this further. GO， KEGG， and GSEA techniques were used to examine the pathways for which CHPF2 may be enriched. Initially， three approaches（TIMER， CIBERSORT， and ssGSEA） were utilized to investigate immune infiltration in the high and low-risk groups of CHPF2， and finally， the immunological checkpoints of CHPF2 were examined. To further corroborate the dependability， Western blotting was used to demonstrate the elevated expression of CHPF2 in gliomas relative to normal tissues. Conclusion CHPF2 may be able to influence the occurrence， progression and prognosis of glioma and may serve as a biomarker for the prognosis of glioma patients.

Key words： glioma; CHPF2; bioinformatics; immunology; prognosis

基金項目：淮安市自然科學研究計劃項目（HAB202118）

作者單位：223002 淮安，徐州醫科大學附屬淮安醫院

通信作者：鄭金玉

膠質瘤是起源于神經上皮的惡性腫瘤，由于膠質瘤的發病機制復雜，導致其具有侵襲性強、易復發、預后差等特點［1-2］，目前尚無有效的膠質瘤治療策略。雖然一些標志物的發現對膠質瘤的分類和診斷起到了重要作用，但目前的早期診斷和臨床治療效果仍不理想。因此，進一步探索膠質瘤潛在的重要標志物具有重要意義。

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一種多糖，由 N-乙酰-D-半乳糖胺和D-葡萄糖醛酸殘基的重復二糖單元組成，在不同位置用硫酸化殘基修飾。CS生物合成和硫酸化平衡受到嚴格控制，并在疾病的進展中發揮重要作用［3-4］。此外，碳鏈的特定硫酸化模式決定了其功能和結合親和力，利用降解銫鏈的抑制劑或酶的研究表明，銫對腫瘤轉移、增殖和黏附過程有相當大的影響［5-6］。軟骨素聚合因子（chondroitin polymerization factor，CHPF）是軟骨素聚合活性所必需的一種獨特的蛋白質因子，對它的鑒定可能會闡明CS的分子基礎。本研究經過查詢相關文獻發現，CHPF在膠質瘤進展中起重要作用［7-9］，同樣，CHPF在其他腫瘤中的表達水平也進行了相關研究［10-11］；而CHPF2是否也具有和CHPF一樣的作用，目前暫未發現相關性研究報道。

本研究基于生物信息學，分析CHPF2在膠質瘤中的表達、預后及與免疫的關系，為并通過實驗作進一步驗證，為進一步研究CHPF2在膠質瘤發生發展中的作用機制和治療等提供依據和參考。

1 資料與方法

1.1 數據下載與處理 從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下載了698例膠質瘤樣本及與其匹配的臨床信息。從中國腦膠質瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）數據庫（http：//www.cgga.org.cn/）中下載了1 018例膠質瘤樣本及相應的臨床信息?；騃D的轉換使用Perl腳本，數據的處理和矯正采用R軟件（版本4.1.2）。臨床信息缺失和生存時間為0 d的樣本予以刪除。

1.2 生存和預后分析 TCGA和CGGA數據庫中的臨床病理特征在CHPF2高低表達組中的差異性采用R包“ggpubr”分析，本研究中生存曲線、ROC曲線、獨立預后及Meta分析均采用R軟件進行分析并可視化（涉及的R包中包括“survival、survivalROC、pROC、survcomp、Meta”等）。

1.3 富集分析及共表達分析 基因蛋白間的相互作用關系使用STRING（https：//string-db.org/）網站生成，圖形繪制使用“Cytoscape”軟件完成，核心基因按照中介中心性進行篩選。 采用R包“clusterProfiler、org.Hs.eg.db、digest、GOplot、enrichplot、ggplot2”進行GO和KEGG富集分析。GSEA富集分析采用GSEA軟件完成。基因間的共表達分析使用R包“corrplot”完成。

1.4 免疫 免疫浸潤使用TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三種方法聯合分析，使用R包“pheatmap”進行可視化。免疫檢查點基因與CHPF2的spearman相關性分析采用R包“ggpubr、corrplot”進行可視化。

1.5 主要試劑 CHPF2抗體購買自Sigma公司。ECL試劑盒購買自賽默飛世爾科技有限公司。PAGE凝膠快速準備試劑盒購買自大連美倫生物技術有限公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5x）和BCA蛋白濃度測定試劑盒購買自碧云天生物技術有限公司。蛋白酶抑制劑購自GLPBIO公司。PVDF膜購買自Millipore公司。鼠抗人β-Actin單克隆抗體、山羊抗鼠IgG購買自Cell Signaling公司。

1.6 Western Blot 正常膠質細胞系（HA1800）和膠質瘤細胞系（C6、T98G和U87）由徐州醫科大學神經系統疾病研究所提供。細胞在37 ℃、5%CO2、相對濕度90%的培養箱中進行培養。收集細胞蛋白前使用冰PBS對培養的細胞進行清洗，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，用細胞刮收集細胞至EP管，置于冰上充分裂解30 min。然后將EP管放置于4 ℃離心機中進行離心，收集上清液于新離心管中。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測上清液中的總蛋白并進行配平，加入5xSDS蛋白上樣緩沖液混勻，金屬浴100 ℃煮沸10 min。將煮沸變性的蛋白樣品進入濃縮膠，電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉到PVDF膜上。3% BSA室溫下封閉2 h，加入一抗工作液，4 ℃孵育過夜。TBST清洗條帶，加入二抗工作液，室溫孵育2 h。繼續使用TBST清洗條帶，然后將ECL顯影液滴加至PVDF膜上，置于凝膠成像系統中曝光顯影。使用Image J分析目的條帶與各自內參的灰度值比值，判斷目的蛋白的表達水平。

1.7 統計學分析 所有統計學分析均采用R（版本 4.1.2）軟件完成。所有統計檢驗均為雙側，以P<0.05認為差異具有統計學意義。其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

2 結 果

2.1 CHPF2在膠質瘤中的表達分析 本研究首先在GEPIA數據庫中分析了CHPF2在正常與低級別膠質瘤組織、正常與高級別膠質瘤組織中的表達水平。隨后，TCGA和CGGA數據庫的分析結果顯示，隨著腫瘤級別的增高，CHPF2的表達水平也隨之升高。為了進一步驗證上述結果，本研究在HPA數據庫中對CHPF2的免疫組化進行分析，結果同樣表明，CHPF2隨著腫瘤的進展，其表達水平也在逐漸升高，所以CHPF2的表達與腫瘤分級呈正相關。見圖1。

2.2 CHPF2的表達與膠質瘤患者的臨床病理特征之間的關系 在TCGA和CGGA兩個數據庫共有的臨床特征中，除性別外，CHPF2表達量在臨床病理特征的分組中均具有統計學意義；此外，在CGGA數據庫中，膠質瘤患者再發情況以及是否放療與CHPF2表達水平無統計學意義。見圖2。

2.3 CHPF2與常見膠質瘤預后標志物對生存的預測在剔除TCGA和CGGA數據庫中生存信息缺失的臨床樣本后，CHPF2低表達組患者的總體生存率高于高風險組，CHPF2表達對于1年、3年、5年膠質瘤患者的生存率均有良好的預測能力（圖3）。通過查閱相關文獻，本研究選取了膠質瘤患者常見的幾個預后標志物，利用ROC曲線和C-index指數比較了它們與CHPF2對膠質瘤患者總體生存率的預測，結果表明，與其他標志物相比，CHPF2仍具有較好的生存預測能力。為了進一步展現CHPF2的預測能力，本研究還比較了各臨床預后標志物對膠質瘤患者1年、3年生存率的預測，得到的結果與總體生存的結果一致（圖4）。

2.4 獨立預后與Meta分析 為了驗證CHPF2是否可以作為預測膠質瘤患者預后的獨立危險因素，本研究采用Cox回歸模型來評估CHPF2的表達與臨床特征。首先，通過單因素Cox回歸分析來觀察CHPF2表達量和每一個臨床特征是否與生存相關，隨后將單因素中Cox回歸分析得到的與生存顯著相關的特征提取出來，利用多因素Cox回歸同時檢測多個特征是否與生存相關。對TCGA和CGGA數據庫中共有的臨床特征進行分析，無論是單因素還是多因素Cox分析，CHPF2均可以作為膠質瘤患者預后的獨立危險因素（圖5）。隨后，本研究對CGGA數據庫中的復發類型以及放化療與CHPF2表達進行生存分析，分析結果均具有統計學意義。為了進一步證實結果的可靠性，本研究通過Meta分析對TCGA和CGGA數據庫分析的結果進行綜合分析（圖6）。因此，CHPF2可以作為膠質瘤患者預后的獨立危險因素。

2.5 富集分析 在確定了CHPF2在膠質瘤中的預后價值后，本研究進行了其在膠質瘤中的生物功能分析。首先，對TCGA和CGGA數據庫中CHPF2高低表達組中具有差異性表達的基因取交集，發現TIMP1、MMP9、COL3A1、ANXA1、ANXA2、S100A4、COL1A1和POSTN是其中的核心基因。單因素Cox分析表明，這些核心基因均與膠質瘤患者的預后有關。接下來，對差異性表達的基因進行GO和KEGG富集分析（圖7），對GO富集分析的結果進行注釋（表1）。最后，本研究還對CHPF2進行了GSEA富集分析，對分析結果進行了可視化（圖8），對結果進行了匯總（表2）。

2.6 共表達分析 在TCGA和CGGA數據庫中，對CHPF2進行基因間的共表達分析。分別選取呈正/負相關系數（cor）前10的20個基因進行熱圖的繪制（圖9）。與CHPF2呈正相關/負相關的基因以及它們的表達值見表3。

2.7 免疫浸潤和免疫檢查點 為了進一步分析膠質瘤患者中CHPF2表達與不同免疫細胞和免疫功能之間的關系，本研究使用TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三種方法綜合分析免疫細胞和免疫功能在CHPF2高低表達組中的表達水平。本研究以熱圖的形式對分析結果進行可視化（圖10）。近年來，免疫檢查點阻斷療法已在多種類型的腫瘤治療中表現出顯著療效。通過查閱相關文獻，本研究選擇免疫檢查點中關鍵的一些基因（CD86、PDCD1LG2、CD48、CD40、IDO1、CD200、PDCD1和CD274）進行研究。結果表明，CHPF2與CD200呈負相關，與CD86、PDCD1LG2、CD48、CD40、IDO1、PDCD1和CD274呈正相關（圖11）。

2.8 Western Blot 本研究使用神經膠質細胞（HA1800）和人膠質瘤細胞系（C6、T98G和U87）驗證了CHPF2在兩者中的蛋白表達水平，結果顯示，與正常膠質細胞相比，CHPF2的蛋白表達水平在膠質瘤細胞中更高（圖12）。

3 討 論

從組織學來源上說，膠質瘤是源于異常增生的膠質細胞，是神經系統中最常見的原發性惡性腫瘤。盡管目前普遍采用手術切除、放療和化療的聯合治療手段，但由于腫瘤容易復發的特點，嚴重影響患者的生活質量，總生存率仍然十分不樂觀。目前雖然在很多方面取得了很大的技術進步，例如臨床影像學、手術治療和輔助治療，但膠質瘤患者的臨床預后仍然很差。因此，尋找神經膠質瘤的潛在治療靶點至關重要。隨著基因組分析技術的發展，人們發現了更多與膠質瘤預后相關的標志物。這些研究為膠質瘤的治療帶來了新的方向。

基于生物信息學，本研究分析了CHPF2在膠質瘤中的表達和預后意義。本研究發現，CHPF2在膠質瘤中的表達水平明顯高于正常組織，并且隨著腫瘤等級的升高，其表達量也隨之上升。CHPF2的表達與多種臨床病理特征有關。通過對膠質瘤患者CHPF2與總生存期（overall survival，OS）的相關性分析，發現膠質瘤患者CHPF2的表達水平越高，OS越低。與其他常見的膠質瘤預后標志物相比，其對膠質瘤患者生存的預測仍具有較高水平。通過Cox回歸和Meta分析， 本研究發現CHPF2可以作為一個獨立的預后因素。為了進一步研究CHPF2的生物學功能，本研究通過GO、KEGG和GSEA富集分析的方法對其可能存在的潛在通路進行了預測。

本研究還通過共表達分析篩選出與CHPF2關聯性最強的一些基因，這些基因與腫瘤的發生發展有著密切關聯。如在TCGA數據庫中，呈正相關的前5個基因（PDIA4、PLOD3、CD276、KDELR2和TMEM214）與膠質瘤的發生發展關系密切［12-16］，呈負相關的前5個基因（MXI1、ALDH5A1、THRA、RAB5B和IGIP）中，未發現IGIP在膠質瘤中的相關文獻報道，但其他基因與膠質瘤關系密切［17-20］。在CGGA數據庫，呈正相關的5個基因（CD276、PLOD3、ZYX、FAM20C和CD151）中，PLOD3和CD276在TCGA數據庫中同樣與CHPF2呈正相關，而ZYX、FAM20C和CD151均在膠質瘤中起著重要作用［21-23］。在呈負相關的基因（CDR1、TUB、RIMS1、NALCN和FAM169A）中，也得到了同樣的結果［24-28］。

免疫治療通過激活人體本身的免疫系統，依靠自身的免疫機能殺滅癌細胞。雖然免疫療法的成功令人振奮，無數患者在它的干預下取得了顯著療效。但仍有一部分患者對免疫療法沒有反應。通過進一步分析和了解腫瘤免疫微環境將有助于免疫治療反應性的改善。本研究基于TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三種方法，分析了免疫細胞和免疫功能與CHPF2表達間的關系，并且對免疫檢查點中的關鍵基因和CHPF2進行了相關性的分析。本研究最后使用蛋白質印跡法對CHPF2在正常和膠質瘤細胞間表達水平進行分析，實驗結果進一步證實了分析結果。

綜上所述，本研究通過多維數據分析，揭示了CHPF2表達水平與膠質瘤的發生和預后相關，這可能有助于識別新的生物標志物和靶向治療策略的發展。

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（收稿2021-12-30 修回2022-05-11）