LncRNA SLC26A4-AS1在人垂體瘤組織中的表達及其意義

彭超 李晏麗 袁勇

【摘要】 目的 探討lncRNA SLC26A4-AS1在人垂體瘤中的表達情況，并分析其與垂體瘤侵襲性的關系。方法 收集經病理確診的16例非侵襲性垂體瘤和25例侵襲性垂體瘤，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測SLC26A4-AS1在人垂體瘤中的表達，并進一步分析SLC26A4-AS1與垂體瘤臨床參數的相關性。結果 與非侵襲性垂體瘤相比，SLC26A4-AS1在侵襲性垂體瘤中表達降低；與無功能瘤相比，SLC26A4-AS1在泌乳素瘤、生長激素瘤和促腎上腺皮質激素瘤中表達無明顯差異。與SLC26A4-AS1高表達組相比，SLC26A4-AS1低表達組中腫瘤體積≥3 cm3的比例明顯增加、侵襲性垂體瘤的比例明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論 SLC26A4-AS1在侵襲性垂體瘤中表達降低，SLC26A4-AS1的低表達與腫瘤體積和侵襲性相關。

【關鍵詞】 垂體瘤；侵襲性；長鏈非編碼RNA；SLC26A4-AS1

【中圖分類號】 R739.41 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0183-06

Abstract： Objective To investigate the expression of lncRNA SLC26A4-AS1 in human pituitary adenoma and analyze its relationship with the invasiveness of pituitary adenoma. Methods The expression of SLC26A4-AS1 was measured in 41 specimens of pituitary adenomas including invasive pituitary adenomas（n=21） and noninvasive pituitary adenoma（n=16） by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Then， the correlation between SLC26A4-AS1 expression and clinical features of patients with pituitary adenomas were analyzed. Results The expression of SLC26A4-AS1 was decreased in invasive pituitary adenomas compared with noninvasive pituitary adenomas. There was no difference of SLC26A4-AS1 expression between PRL adenoma， GH adenoma and ACTH adenoma and nonfunctional adenomas. Compared with the SLC26A4-AS1 high-expression group， the proportion of tumor volume ≥3 cm3 and the proportion of invasive pituitary adenoma in the SLC26A4-AS1 low-expression group were significantly increased（P<0.05）. Conclusions The expression of SLC26A4-AS1 is decreased in invasive pituitary adenomas. The expression of SLC26A4-AS1 is related to tumor volume and invasiveness.

Key words： pituitary adenoma; invasiveness; long non-coding RNA; SLC26A4-AS1

基金項目：廣州市衛生健康科技一般引導項目（20201A011079）

作者單位：510080 廣州，廣東省人民醫院神經外科（彭超）；廣州醫科大學附屬第二醫院內分泌科（李晏麗）；昆明醫科大學第二附屬醫院神經外科（袁勇）

通信作者：袁勇

垂體瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤之一，占顱內腫瘤的10%～20%左右［1］。既往研究表明，垂體瘤雖然是一類良性腫瘤，但仍有相當一部分會侵襲海綿竇、蝶竇、骨質等周圍結構，表現為侵襲性生長，即侵襲性垂體瘤［2］。侵襲性垂體瘤手術后容易殘留或復發，給臨床治療帶來極大困難［3］。探究侵襲性垂體瘤的發病機制及尋找預測垂體瘤侵襲性和術后復發的標記物是最近的研究熱點［4-6］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， lncRNA）是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，不具有編碼蛋白功能，但可通過基因組印記、染色質修飾、染色體沉默、轉錄激活、轉錄沉默等方式，在表觀遺傳學、轉錄調控、轉錄后調控等層面參與基因調控過程［7］。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的lncRNAs被發現與腫瘤的增殖、侵襲、轉移及預后等相關［8-9］。近年來研究表明，一些lncRNAs參與垂體瘤侵襲、進展、復發等過程［6，10-11］。目前研究表明，lncRNA中的溶質載體家族26成員4的反義RNA 1（solute carrier family 26 member 4 antisense RNA 1，SLC26A4-AS1）與多種腫瘤的增殖、進展和預后相關［12-15］，但其在垂體瘤中的表達作用，尤其是與侵襲性相關的情況尚不清楚。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）對16例非侵襲性垂體瘤和25例侵襲性垂體瘤組織中SLC26A4-AS1的表達進行檢測，探討其在垂體瘤中的表達情況，并分析其表達變化與垂體瘤侵襲性的關系。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 所有垂體瘤標本均來自廣東省人民醫院神經外科，所有患者均接受蝶竇入路的垂體瘤切除術。垂體瘤的診斷基于臨床表現、激素分泌生化特征、MRI和手術切除后兩位病理醫師證實的組織病理學分析［2］。非侵襲性垂體瘤的定義是垂體瘤局限于鞍區，不壓迫周圍結構，Knosp分級為 Ⅰ-Ⅱ級。侵襲性垂體瘤的定義根據Knosp分級為 Ⅲ-Ⅳ級［16］。本研究共納入41例標本，包含16例非侵襲性垂體瘤和25例侵襲性垂體瘤，將其按分泌功能分為：無功能瘤25例，泌乳素瘤（prolactin瘤，PRL瘤）6例，生長激素瘤（growth hormone瘤，GH瘤）6例，促腎上腺皮質激素瘤（adrenocorticotropic hormone瘤，ACTH瘤）3例，促甲狀腺激素瘤（thyrotropin瘤，TSH瘤）1例。垂體瘤體積計算方式是利用MRI測量并記錄垂體瘤的三個平面，即橫斷面（TR）、正位面（AP）和顱側面（CC）的尺寸，垂體瘤體積的估算公式為： V=（π×［TR×AP×CC］）/6［17］。根據術中腫瘤切除情況及術后72 h的MRI復查結果，計算腫瘤的切除率，定義完全切除為腫瘤切除100%，部分切除，為腫瘤切除≤75%。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意書。

1.1.2 試劑和儀器 Trizol試劑：Invitrogen，美國；逆轉錄試劑盒：Promega，美國；qRT-PCR試劑盒：Takara，日本；引物：生工生物，中國；NanoDrop 2000分光光度計：Thermo Fisher，美國；qRT-PCR儀：Applied Biosystems（ABI），美國。

1.2 垂體瘤SLC26A4-AS1測定 手術切除后，所有垂體瘤組織樣本立即被冷凍在液氮中，并保存在-80 ℃以待檢。所有垂體瘤樣本經過勻漿儀勻漿后，根據操作說明，使用Trizol試劑提取總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計測定總RNA的濃度，并使用吸光度A260/A280對其純度進行評估。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR操作，反應體系：SYBR Green 5.0 μL，無RNA酶水3.0 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，總體積為10.0 μL。qRT-PCR獲取SLC26A4-AS1及內參基因actin的Ct值后，用Ct值比較法計算SLC26A4-AS1在各組間的相對表達量（2-ΔΔCt）。SLC26A4-AS1的上、下游引物序列分別為5′-ACACGCGGGAAGGAATAAACT-3′和5′-GGTAGG-ATAGCTCCAGCTCCT-3′；actin的上、下游引物序列分別為5′-TGTGGATCGGTGGCTCCATCCT-3′和5′-AAA-CGCAGCTCAGTAACAGTC CGC-3′。

1.3 隨訪 對41例患者定期于門診復查或電話等方式進行隨訪，隨訪時間為出院日至2021年9月30日，患者死亡、脫失或復發即為終止。利用UCSC Genome Browser軟件（https：//genome.ucsc.edu/）分析SLC26A4-AS1在人各組織中的表達情況。

1.4 統計學分析 計量資料以均數±標準差（x-±s）表示，計數資料以百分比表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用One-way ANOVA分析。將本研究中垂體瘤組織SLC26A4-AS1的相對表達水平的中位數為界限［18］，將41例垂體瘤患者分為SLC26A4-AS1低表達組和SLC26A4-AS1高表達組，分析兩組間臨床資料的差異。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析和曲線下面積（area under curve，AUC）來評估SLC26A4-AS1對侵襲性垂體瘤的診斷能力。所有的統計分析都是采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 垂體瘤的臨床資料 非侵襲性垂體瘤和侵襲性垂體瘤的典型MRI見圖1。將41例患者分為非侵襲性組（16例）和侵襲性組（25例），兩組平均年齡分別為（43.56±10.46）歲、（46.08±14.04）歲，兩組在年齡、性別、分泌功能、腫瘤體積、腫瘤分類及手術方式上無統計學差異（表1）。

2.2 各組垂體瘤中SLC26A4-AS1的表達 與非侵襲性垂體瘤相比，侵襲性垂體瘤中SLC26A4-AS1的表達水平明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖2A。與無功能瘤相比，PRL瘤、GH瘤和ACTH瘤中SLC26A4-AS1的表達水平無顯著差異，見圖2B。

2.3 侵襲性情況 將本研究中垂體瘤組織中SLC26A4-AS1的相對表達水平的中位數為界限，將41例垂體瘤患者分為SLC26A4-AS1低表達組和SLC26A4-AS1高表達組，與SLC26A4-AS1高表達組相比，SLC26A4-AS1低表達組中腫瘤體積≥3 cm3的比例明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2；與SLC26A4-AS1高表達組相比，SLC26A4-AS1低表達組中侵襲性垂體瘤的比例明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。而SLC26A4-AS1低表達組和SLC26A4-AS1高表達組在年齡、性別、Ki-67%和手術切除程度上，無統計學差異（表2）。

2.4 SLC26A4-AS1對侵襲性垂體瘤的診斷價值通過ROC曲線分析，確定SLC26A4-AS1對侵襲性垂體診斷的敏感性和特異性（圖3），其AUC為0.693（95% CI=0.527～0.858）。

2.5 SLC26A4-AS1在人各組織上表達情況及其與腫瘤相關的研究 利用UCSC Genome Browser軟件分析SLC26A4-AS1在人各組織中的表達情況，本研究發現SLC26A4-AS1在甲狀腺中表達最豐富，在腦組織中表達較豐富（圖 4）。該研究利用Pubmed搜索并總結了目前已發表的關于SLC26A4-AS1與腫瘤的研究報道（表3），可見在大多數的腫瘤中SLC26A4-AS1表達下降，表達下降的SLC26A4-AS1可促進腫瘤的侵襲、轉移等，這與本研究在垂體瘤中的研究結果一致。

3 討 論

垂體腺瘤是最常見的原發性腦腫瘤之一，其患病率約為80～90/10萬人，并且有高達20%的復發率［24］。按照影像學資料結合術中所見可將垂體瘤分為非侵襲性和侵襲性垂體瘤［25］，但目前仍沒有關于垂體瘤侵襲性行為和復發的較可靠的預測因子。因此，探討侵襲性垂體瘤的發病機制及尋找能高效診斷侵襲性垂體瘤的研究理應受到關注。

lncRNAs是一類長度超過200個核苷酸且基本無蛋白質編碼功能的內源性轉錄本，可參與人體內多種生物學過程，近年來許多研究發現lncRNAs在許多腫瘤的發生發展中發揮著重要的調控作用，如參與增殖、凋亡、侵襲、轉移和遷移等生物學過程［8］。

SLC26A4-AS1位于第7號染色體長臂的2區2帶，全長為3 888個核苷酸。既往研究報道，SLC26A4-AS1在甲狀腺組織表達豐富，多項研究表明SLC26A4-AS1在甲狀腺癌組織中表達降低，表達降低的SLC26A4-AS1促進甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移等過程，參與甲狀腺癌轉移、復發等，并且與甲狀腺癌的生存率相關［14，19-22］。Wang等［14］{Wang，2020 #8}研究表明甲狀腺癌組織中SLC26A4-AS1表達降低，在甲狀腺癌細胞中過表達SLC26A4-AS1可上調腫瘤蛋白53（tumor protein，TP53）而抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路，從而減少甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而且促進細胞凋亡，從而具有抗腫瘤的作用。Yuan等［21］研究也表明在甲狀腺癌組織中SLC26A4-AS1表達下降，SLC26A4-AS1下調可激活DNA修復，從而促進甲狀腺癌細胞的轉移。Peng等［22］研究表明過表達SLC26A4-AS1可通過促進肌醇1，4，5-三磷酸受體1型（ITPR1）介導的自噬，從而抑制甲狀腺乳頭狀癌的進展。但亦有一項研究報道，SLC26A4- AS1在甲狀腺癌組織中表達升高，在甲狀腺癌中扮演促癌因子的角色［23］。Li等［15］研究發現，SLC26A4-AS1通過上調神經穿透素1（NPTX1）在膠質瘤中發揮抗血管生成的作用。Wu等［13］發現在乳腺癌中SLC26A4-AS1表達下降，且與乳腺癌的生存率相關。Li等［12］研究表明，在胃癌中SLC26A4-AS1表達下降，與胃癌的生存率相關。上述研究都提示，SLC26A4-AS1與腫瘤侵襲性等關系密切進而影響腫瘤的侵襲及轉移生長等生物學行為。為分析SLC26A4-AS1在垂體瘤中的表達水平及其與侵襲性的關系，本研究對16例非侵襲性垂體瘤和25例侵襲性垂體瘤進行qRT-qPCR檢測SLC26A4-AS1在非侵襲性垂體瘤和侵襲性垂體瘤中的表達情況，結果發現，與非侵襲性垂體瘤相比，SLC26A4-AS1在侵襲性垂體瘤中表達明顯降低。通過將SLC26A4-AS1的表達分為SLC26A4-AS1低表達組和SLC26A4-AS1高表達組，本研究發現與SLC26A4-AS1高表達組相比，SLC26A4-AS1低表達組中腫瘤體積＞3 cm3和侵襲性垂體瘤的比例明顯增加，差異具有統計學意義。通過ROC曲線分析發現，SLC26A4-AS1診斷侵襲性垂體瘤的曲線下面積為0.693，其是否可聯合影像學或者免疫組化等參數提高診斷侵襲性垂體瘤的特異性和敏感性等有待進一步研究。

盡管本研究首次報道了SLC26A4-AS1在垂體瘤中的表達情況及其與垂體瘤侵襲性的相關情況，但本研究仍存在局限性：（1）本研究缺乏正常垂體組織，未能探討與正常垂體組織相比，垂體瘤中SLC26A4-AS1的表達情況；（2）由于垂體微腺瘤進行手術的比較少，本研究所納入的病例是大腺瘤或者巨大腺瘤，未納入微腺瘤，未能進一步分析SLC26A4-AS1在微腺瘤、大腺瘤和巨大腺瘤中的表達情況；（3）本研究隨訪時間最長的為1年，總體隨訪時間不長，暫未能觀察到SLC26A4-AS1與垂體瘤預后的相關性；（4）本研究缺乏機制研究，SLC26A4-AS1調控垂體瘤細胞的侵襲、遷移等生物學行為的相關機制未能在此研究中闡明。

與非侵襲性垂體瘤相比，SLC26A4-AS1在侵襲性垂體瘤組織中表達水平明顯降低，提示SLC26A4-AS1可能在垂體瘤中的侵襲生長過程中發揮重要。

［參 考 文 獻］

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（收稿2021-12-31 修回2022-05-04）