多房棘球蚴源性外泌體對巨噬細胞極化的影響

冶賡博 陳功富 崔紫煙 吳俊杰 黃登亮 尹鳳嬌 王志鑫 于文昊 孔繁玉 樊海寧 任利

摘要：目的 探究不同時間及濃度多房棘球蚴源性外泌體對巨噬細胞極化的影響。方法 從60只造模BALB/c小鼠中隨機選取4只，應用7.0T MRI觀察腹腔病灶生長情況；解剖造模小鼠，通過腹腔病灶提取原頭節進行體外培養，超速離心法從培養上清中提取外泌體，透射電鏡及蛋白質免疫印跡法鑒定外泌體表征。將未加外泌體處理的巨噬細胞單獨培養組設為對照組，不同濃度多房棘球蚴來源外泌體與巨噬細胞共培養組設為實驗組（10 μg/mL組、50 μg/mL組），分別共培養48 h和72 h，顯微鏡下觀察巨噬細胞形態變化。通過流式細胞術和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測極化狀態。符合正態分布的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果 7.0T MRI顯示小鼠腹腔內彌漫分布、大小不等的病灶形成；多房棘球蚴源性外泌體直徑100 nm左右，呈杯型或茶托型，其表面標志物CD9、TSG101和CD63表達陽性。共培養后，實驗組大部分細胞拉長，形態不規則，主要呈多角形；流式細胞術檢測發現，共培養48 h，對照組CD16/32、CD206、CD369陽性率分別為（99.53±0.06）%、（90.27±0.21）%、（2.40±0.20）%；與對照組相比，除10 μg/mL外泌體組CD369陽性率［（0.80±0.00）%］降低（P＜0.05），其余組別CD16/32、CD206、CD369陽性率均明顯升高（P值均＜0.000 1）；共培養72 h，對照組CD16/32、CD206、CD369陽性率分別為（99.67±0.06）%、（85.47±0.55）%、（6.60±0.20）%，實驗組CD16/32、CD206、CD369陽性率較對照組均明顯升高（P值均＜0.05）。ELISA結果示：共培養48 h，對照組IL-6及TNFα水平分別為（58.53±15.52） pg/mL、（320.70±5.30）pg/mL，實驗組外泌體濃度為50 μg/mL時IL-6［（98.81±15.55） pg/mL］較對照組升高（P＜0.05）；共培養72 h，對照組IL-6及TNFα水平分別為（76.22±9.68）pg/mL、（323.90±87.37）pg/mL，當外泌體濃度為10 μg/mL時TNFα水平［（164.20±14.17）pg/mL］較對照組明顯下降（P＜0.05）；當外泌體濃度為50 μg/mL時IL-6水平［（99.52±8.35）pg/mL］較對照組升高（P＜0.05）。結論 多房棘球蚴源性外泌體可調控巨噬細胞極化，且在濃度為10 μg/mL，共培養72 h后，可導致巨噬細胞M2樣極化，具體方式有待進一步研究。

關鍵詞：棘球蚴病， 肝； 外泌體； 巨噬細胞； 小鼠， 近交BALB C

基金項目：青海省科技廳項目（2019-ZJ-7031）

Effect of exosomes derived from Echinococcus multilocularis on macrophage polarization： A preliminary study

YE Gengbo1，2， CHEN Gongfu1，2， CUI Ziyan1，2， WU Junjie1，2， HUANG Dengliang2， YIN Fengjiao1，2， WANG Zhixin1，2， YU Wenhao1，2， KONG Fanyu1，2， FAN Haining1，2， REN Li1，2. （1. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery， The Affiliated Hospital of Qinghai University， Xining 810001， China; 2. Qinghai Province Key Laboratory of Hydatid Disease Research， Xining 810001， China）

Corresponding author：

REN Li， renliweimin_xn@126.com （ORCID：0000-0001-6306-3533）

Abstract：

Objective To investigate the effect of exosomes derived from Echinococcus multilocularis on macrophage polarization after treatment for different durations and concentrations. Methods A total of 60 BALB/c mice were used for modeling， among which 4 mice were selected to observe the growth of abdominal lesions on 7.0T MRI. The mice for modeling were dissected， and the protoscoleces was taken from the abdominal lesion and cultured in vitro; ultracentrifugation was used to extract the exosomes from the supernatant， and transmission electron microscopy and Western blotting were used for the characterization of exosomes. The macrophages without exosome treatment were established as control group， and the macrophages co-cultured with different concentrations of exosomes derived from Echinococcus multilocularis were established as experimental group （10 μg/mL group and 50 μg/mL group） and were cultured for 48 and 72 hours. The morphological changes of macrophages were observed under a microscope， and flow cytometry and ELISA were used to observe polarization state. A one-way analysis of variance was used for comparison of normally distributed continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results The results of 7.0T MRI showed the formation of diffuse lesions with different sizes in the abdominal cavity of mice， and the exosomes derived from Echinococcus multilocularis were approximately 100 nm in diameter and were cup-shaped or saucer-shaped， with the positive expression of the surface markers CD9， TSG101， and CD63. After co-culture， most of the cells in the experimental group were elongated with an irregular and polygonal shape. Flow cytometry showed that after 48 hours of co-culture， the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 in the control group were 99.53%±0.06%， 90.27%±0.21%， and 2.40%±0.20%， respectively; compared with the control group， except that the 10 μg/mL exosome group had a significant reduction in the positive rate of CD369 （0.80%±0.00%） （P＜0.05）， all the other groups had a significant increase in the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 （all P＜0.000 1）; after 72 hours of co-culture， the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 in the control group were 99.67%±0.06%， 85.47%±0.55%， and 6.60%±0.20%， respectively， and compared with the control group， the experimental group had significant increases in the positive rates of CD16/32， CD206， and CD369 （all P＜0.05）. ELISA showed that after 48 hours of co-culture， the levels of IL-6 and TNFα in the control group were 58.53±15.52 pg/mL and 320.70±5.30 pg/mL， respectively， and when the exosome concentration was 50 μg/mL， the level of IL-6 in the experimental group was 98.81±15.55 pg/mL， which was higher than that in the control group （P＜0.05）; after 72 hours of co-culture， the levels of IL-6 and TNFα in the control group were 76.22±9.68 pg/mL and 323.90±87.37 pg/mL， respectively， and when the exosome concentration was 10 μg/mL， the level of TNFα was 164.20±14.17 pg/mL， which was significantly lower than that in the control group （P＜0.05）; when the exosome concentration was 50 μg/mL， the level of IL-6 was 99.52±8.35 pg/mL， which was significantly higher than that in the control group （P＜0.05）. Conclusion Exosomes derived from Echinococcus multilocularis can regulate macrophage polarization and induce M2-like polarization of macrophages after co-culture at a concentration of 10 μg /mL for 72 hours， and further studies are needed to clarify the specific method.

Key words：

Echinococcosis， Hepatic； Exosomes； Macrophages; Mice， Inbred BALB C

Research funding：

Project of Qinghai Provincial Department of Science and Technology （2019-ZJ-7031）

棘球蚴病俗稱包蟲病，分為細粒棘球蚴病和多房棘球蚴病（alveolar echinococcosis，AE）。AE由于浸潤性生長和轉移特點，故有“蟲癌”之稱，對人類健康和社會經濟威脅更為嚴重［1］。巨噬細胞是先天免疫的重要成員，M1型巨噬細胞可分泌如TNFα、IL-6及低水平IL-10等促炎因子，還可通過上調MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子CD40、CD80及CD86，幫助機體抵御多種病原體的侵害［2］;M2型可表達IL-10、TGFβ等抗炎分子，并通過高表達CD206、CD301和CD369等受體發揮吞噬作用［3-4］。現研究［5-6］認為M2型巨噬細胞極化與維持慢性炎癥、免疫抑制及腫瘤生長有關。巨噬細胞在受到不同微環境刺激后，通過M1/M2表型的轉化，發揮不同的功能。外泌體是由多種細胞分泌的納米級囊泡外小體，被視為細胞間“通訊特工”，在調節細胞功能中起著重要作用［7］。

當多房棘球蚴侵入機體后，與宿主建立的復雜免疫抑制機制能成功使其躲避宿主免疫系統的殺傷并長期存活［8-9］，多項研究表明，血吸蟲［10］、馬來絲蟲［11］、弓形蟲［12］等寄生蟲源性外泌體可通過調節巨噬細胞極化從而協助免疫逃逸，然而，多房棘球蚴來源的外泌體影響巨噬細胞表型和功能的研究較少見。本研究擬采用多房棘球蚴源性外泌體體外刺激巨噬細胞，利用流式和ELISA檢測巨噬細胞表面分子標志物的動態變化，旨在探討多房棘球蚴源性外泌體是否具有促巨噬細胞極化的能力，為進一步研究多房棘球蚴感染免疫逃逸新機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠60只，雌性，體質量16～18 g，10周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司［生產許可證編號：SCXK（京）2019-0008］；種鼠為長爪沙鼠1只，體質量65 g，由青海大學包蟲病重點實驗室提供［生產許可證編號：SCXK（浙）2019-0002］；實驗動物使用許可證號均為：SYXK（青）2020-0001。

1.2 主要試劑及設備 J774A.1小鼠單核巨噬細胞（上海澤葉生物有限公司）；無外泌體胎牛血清（上海逍鵬生物科技有限公司）；IL-6（美國Abcam公司）；TNFα（南京森貝伽生物科技有限公司）；CD369、CD206、CD16/CD32（美國eBioscience 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；小鼠麻醉劑為異氟烷（深圳瑞沃德生命有限公司，試劑編號：R510-22-8）和氧氣的混合氣體；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；Bruker Biospin 70/16小動物專用7.0TMRI掃描系統（德國Bruker公司）；透射電子顯微鏡（日本TEM，Joel 公司）；冷凍高速離心機（美國Thermo 公司）；高速離心機（德國 Eppendorf 公司）；流式細胞儀（美國BD公司）； SDS-PAGE蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 7.0T MRI掃描 BALB/c小鼠腹腔感染原頭節4個月后，隨機選取4只置于密閉麻醉箱內給予異氟烷與氧氣混合氣體麻醉，以俯臥位置于掃描床上，Bruker Biospin 70/16小動物專用7.0TMRI掃描系統進行掃描，了解腹腔病灶生長情況以確定造模成功。

1.3.2 原頭節的提取 頸椎脫臼法處死感染多房棘球蚴的BALB/c模型小鼠，無菌條件下打開腹腔，分離出腹腔中多房棘球蚴病灶組織，無菌PBS液沖洗3次，刀片切碎至糊狀，80目及300目濾網分別反復過濾，獲得乳白色原頭節，置于含10%無外泌體胎牛血清及1 mL 5%雙抗的培養基中，于37 ℃的二氧化碳培養箱中培養3 d，裝入50 mL離心管，800×g離心5 min，吸取培養上清，-80 ℃凍存備用。

1.3.3 外泌體提取及BCA定量 超速離心法提取上清中外泌體：4 ℃、300×g離心10 min，取上清；2 000×g離心10 min、去除死細胞及細胞碎片，取上清；0.22 μm無菌濾器濾過以進一步去除細胞碎片；將濾過液在4 ℃ 140 000×g離心2 h，棄上清，PBS重懸沉淀，獲得的沉淀即為外泌體。鑒定：將沉淀重懸于100 μL PBS中，TEM觀察形態，Western Blot檢測特異性表面標志物CD63、CD9和TSG101的表達，納米顆粒追蹤分析儀分析其直徑。為避免降解于-80 ℃保存備用。將標準品用PBS稀釋為2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.062 5 mg/mL，外泌體稀釋為20 μL作為待測樣本，以PBS作空白對照，每個反應設置3個重復；將200 μL BCA工作液和25 μL樣品加在96孔細胞培養板中并充分混勻，37 ℃靜置30 min；用酶標儀測定并記錄OD562，根據標準曲線和使用的上清液體積計算出上清液的蛋白濃度，以外泌體樣品的蛋白濃度作為外泌體濃度進行后續實驗。

1.3.4 細胞培養 對照組：未加外泌體的巨噬細胞單獨培養；實驗組：多房棘球蚴來源外泌體與巨噬細胞共培養（10 μg/mL組、50 μg/mL組）。分別培養48 h、72 h后，流式和ELISA檢測巨噬細胞標志物（M1：IL-6、TNFα、CD16/32；M2：CD206、CD369）的表達情況，并在顯微鏡下觀察巨噬細胞形態變化。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞比例變化 刺激巨噬細胞48 h、72 h后，當各實驗組細胞覆蓋率達70%～80%時，收集細胞；1 300 r/min、離心3 min，棄上清；PBS 洗滌細胞沉淀，1 300 r/min、離心3 min，棄上清；重復上一步驟；100 μL PBS溶液配成混懸細胞沉淀并加入熒光抗體10 μL，4? ℃、避光條件下孵化0.5 h；離心并收集細胞，PBS 清洗細胞后置于離心機中，以1 300 r/min離心3 min，吸除上清；200 μL PBS溶液配置成混懸細胞沉淀，混勻并轉移至96孔板中，每孔滴入200 μL，上機檢測巨噬細胞極化指標。

1.3.6 極化相關因子的檢測 用ELISA法檢測IL-6及TNFα：收集各組上清液，參考操作說明書，檢測各組細胞因子，據OD值繪制出標準曲線，計算各樣本濃度，所有檢測重復3次。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件分析數據，并用GraphPad Prism 8.3.0軟件繪圖。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 7.0T MRI掃描結果 與正常小鼠相比，實驗組：腹腔內可見彌漫分布、大小不等的多房囊性和少量囊實性病灶；T1WI：呈多房囊狀，部分較大的病灶內可見等信號的分隔；邊界顯示清楚（圖1a）。T2WI：呈高信號及混雜信號，部分可見囊實性改變，實性成分周邊見多發小囊泡結構，部分肝臟受侵（圖1b）。

2.2 多房棘球蚴源性外泌體鑒定 觀察到多房棘球蚴源性外泌體呈杯型或茶托型，雙層膜結構，直徑100 nm左右，背景清晰，無污染（圖2a）；Western Blot結果顯示，標志物CD9和TSG101表達陽性，CD63表達為弱陽性（圖2b）；本實驗使用超速離心法提取的外泌體，結構、大小、濃度及表面標志物均符合要求。

2.3 巨噬細胞形態觀察 共培養48 h、72 h后，顯微鏡下觀察巨噬細胞形態，對照組細胞多呈橢圓形或圓形，而經過不同濃度外泌體處理后，共培養48 h和72 h實驗組大部分細胞拉長，形態不規則，主要呈多角形（圖3）。

2.4 流式細胞術檢測結果 共培養48 h：與對照組相比，除10 μg/mL外泌體組CD369陽性率降低，其余組別CD16/32、CD206、CD369陽性率均明顯升高（P值均＜0.000 1）；共培養72 h：與對照組相比，實驗組CD16/32、CD206、CD369陽性率較對照組均明顯升高（P值均＜0.05）（表1）。隨共培養時間及外泌體濃度變化，相關分子呈現不同變化趨勢（圖4、5）。

2.5 ELISA檢測結果 共培養48 h：與對照組相比，50 μg/mL外泌體組IL-6水平升高（P＜0.05）；共培養72 h：與對照組相比，當外泌體濃度為10 μg/mL時TNFα水平明顯下降（P＜0.05）；當外泌體濃度為50 μg/mL時IL-6水平較對照組升高（P＜0.05）（表2）。TNFα的濃度呈現先下降后升高趨勢，在濃度為10 μg/mL 時，下降顯著（圖6）。

2.6 M2/M1型巨噬細胞相關分子比值 將未予外泌體刺激的巨噬細胞設為對照組，對M2/M1型巨噬細胞的比值進一步行統計分析，結果顯示，濃度為10 μg/mL 刺激72 h后，M2型巨噬細胞相關分子占比顯著增加，差異具有統計學意義（P值均＜0.000 1），再增加外泌體濃度時，其比值出現下降趨勢（表3，圖7）。

3 討論

1983年，Pan和Johnstone兩位學者在實驗時意外發現了直徑30～150 nm 的小囊泡［13］，以此開啟了外泌體世界的大門。從最初被視為細胞排出廢物的途徑［14］，到Raposo等［15］在1996年，提出外泌體參與抗原呈遞和適應性免疫反應，促使其重新受到研究者們的關注。近年來，已證實寄生蟲也能分泌外泌體或者刺激宿主細胞分泌外泌體［9，16-17］，與宿主細胞進行交流，進而調節多種病理生理反應，對寄生蟲的致病力、繁殖力以及免疫逃逸等均產生重要作用。巨噬細胞因極高的可塑性和異質性而被視為免疫系統的精靈，起初以原始巨噬細胞（M0型）處于靜止狀態，當受到外界不同環境因素誘導時，引起表型和功能的變化，稱為巨噬細胞極化［18］。其中M1型和M2型功能迥異，在不同環境下相互轉化、相互制衡。

有研究［19］證實，AE患者在行肝臟切除手術后，巨噬細胞的數量增加，說明巨噬細胞在AE的發展過程中起了作用。也有研究［20］表明，AE患者的肝組織和外周血中，M2/M1比值較健康人群明顯升高。課題組在前期研究［21］中也發現，當多房棘球蚴感染小鼠后，宿主可分泌IL-6、TNFα等炎性細胞因子，上調M1型巨噬細胞的表達，幫助宿主清除病原體；同時，感染多房棘球蚴小鼠的巨噬細胞也可向M2型極化，再次證實多房棘球蚴致病過程中存在巨噬細胞表型的轉變，使其逃避機體內免疫殺傷作用，繼而發生一系列病理損傷。然而，在AE致病過程中，介導巨噬細胞表型轉換的物質尚不明確。前期在AE患者外周血、病灶囊液中分離獲得外泌體發現，從病灶囊液上清中提取的外泌體蛋白含量顯著高于外周血；也在棘球蚴體外培養上清中分離得到外泌體，并發現外泌體相關標志物表達陽性，故推測多房棘球蚴分泌的外泌體在感染機體和在發生免疫逃逸的過程中可能扮演重要角色。

本研究通過構建多房棘球蚴腹腔感染小鼠模型，將7.0T MRI掃描應用于無創了解模型鼠腹腔病灶生長情況后，適時提取多房棘球蚴原頭節，用無外泌體的胎牛血清培養原頭節并分離上清，成功獲取并鑒定多房棘球蚴源性外泌體。在后續進行外泌體與巨噬細胞分組共培養時，觀察到巨噬細胞發生形態的變化，提示外泌體使巨噬細胞發生極化。再利用流式細胞技術和ELISA分別檢測M1和M2型相關指標，結果表明多房棘球蚴源性外泌體可使巨噬細胞發生M1及M2樣極化，這與前期研究結果相一致，即感染多房棘球蚴小鼠病灶中出現 M1型和M2型巨噬細胞雙重浸潤。通過進一步觀察，當外泌體濃度為10 μg/mL培養72 h后，M1型巨噬細胞有關的細胞因子TNFα明顯下降，同時，M2型巨噬細胞有關表面分子CD206及CD369表達水平顯著增加（P值均＜0.05），這表明多房棘球蚴源性外泌體使巨噬細胞向M2型轉化。隨后又進行 M2/M1 型巨噬細胞相關表面分子比值分析，結果顯示以外泌體濃度為10 μg/mL時培養72 h，與對照組相比，CD369/（CD16/32）和CD206/（CD16/32）的比值明顯升高，差異均有統計學意義（P值均＜0.000 1），而且隨著外泌體濃度的增加，M2/M1型巨噬細胞相關指標的比值呈下降趨勢，說明外泌體濃度為10 μg/mL 時，M2 型巨噬細胞明顯增多。因此，體外研究實驗認為多房棘球蚴源性外泌體在濃度為10 μg/mL時是促進M2型巨噬細胞轉化最佳濃度。

綜上所述，在多房棘球蚴感染過程中，存在巨噬細胞表型的轉換；而本研究肯定了多房棘球蚴源性外泌體在巨噬細胞表型轉換中的作用；當外泌體濃度為10 μg/mL，共培養72 h后能有效促進巨噬細胞M2型極化，這可能是多房棘球蚴通過重塑宿主免疫狀態，幫助多房棘球蚴逃脫宿主免疫殺傷作用的新機制。但外泌體中何種物質以及通過何種信號通路發揮作用，還需在此基礎上結合體內實驗進一步進行生物信息學及蛋白組學等方面的研究，進而闡明AE致病過程中，宿主-宿主、宿主-寄生蟲間復雜的分子調控機制，尋找新型治療靶點，為AE診斷的新型生物標志物、臨床藥物開發研究方面奠定基礎。

倫理學聲明：本研究于2019年7月3日經青海大學附屬醫院科研倫理委員會審批，批號為P-SL-2019042，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：冶賡博、陳功富負責課題設計，撰寫論文；黃登亮、崔紫煙、吳俊杰負責實驗實施，數據整理；孔繁玉、于文昊、尹鳳嬌查閱文獻，分析數據；任利、樊海寧、王志鑫負責課題設計，指導撰寫論文并最后定稿。

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收稿日期：

2022-09-27；錄用日期：2022-11-22

本文編輯：林姣