糞腸球菌在酒精性肝病中的研究進展

古镈源 肖勝友 劉琛 程永浪 付文廣

摘要：

酒精性肝病（ALD）是世界范圍內最常見的慢性肝病之一，包括脂肪變性、脂肪性肝炎、纖維化和肝硬化不同階段。糞腸球菌是醫院常見獲得性感染菌群，對于酒精性肝炎患者預后具有重要影響。本篇綜述重點介紹了ALD的發病因素和糞腸球菌的致病機理，總結了糞腸球菌在ALD中的研究進展，簡述了臨床上對于糞腸球菌感染的檢測和治療方法。由于臨床上感染溶細胞性糞腸球菌的ALD患者死亡率極高，因此深入認識糞腸球菌成為當下重要問題。

關鍵詞：

肝疾病， 酒精性； 糞腸球菌； 胃腸道微生物組； 腸黏膜

基金項目：

國家自然科學基金（82170587）； 瀘州市人民政府-西南醫科大學科技戰略合作重點項目（2021LZXNYD-Z01）

Research advances in the role of Enterococcus faecalis in alcoholic liver disease

GU Boyuana， XIAO Shengyoua， LIU Chena， CHENG Yonglanga， FU Wenguanga，b. （a. Department of General Surgery （Hepatopancreatobiliary Surgery）， b. Academician （Expert） Workstation of Sichuan Province， The Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan 646000， China）

Corresponding author：

FU Wenguang， fuwg@swmu.edu.cn （ORCID：0000-0003-3672-9728）

Abstract：

Alcoholic liver disease （ALD） is one of the most common chronic liver diseases worldwide and includes the different stages of steatosis， steatohepatitis， fibrosis， and liver cirrhosis. Enterococcus faecalis is a common bacterium for nosocomial infection and has a significant impact on the prognosis of patients with alcoholic hepatitis. This review mainly introduces the pathogenesis of ALD and the pathogenic mechanism of E. faecalis， summarizes the research advances in E. faecalis in ALD， and briefly describes the detection and treatment methods for E. faecalis infection in clinical practice. Since there is an extremely high mortality rate in ALD patients with lytic E. faecalis infection， an in-depth understanding of E. faecalis has become an important issue nowadays.

Key words：

Liver Diseases， Alcoholic； Enterococcus faecalis;? Gastrointestinal Microbiome;? Intestinal Mucosa

Research funding：National Natural Science Foundation of China （82170587）； Luzhou Municipal Peoples Government-Southwest Medical University Science and Technology Strategic Cooperation Project （2021LZXNYD-Z01）

過量飲酒是當代社會中的一個嚴重健康問題。大量飲酒會導致人體內多器官病變［1］。而肝臟是負責乙醇代謝的主要器官，在過量飲酒后出現氧化應激、乙醛和LPS積累會造成更大的組織損傷［2］。酒精性肝病 （ALD）是世界范圍內與酒精相關發病率和死亡率最高的疾病［2-3］。肝臟與腸道的解剖結構密切相關，而酒精使腸道黏膜受損和糞腸球菌在內的腸道菌群生態失調是ALD發生的重要機制。糞腸球菌是人類腸道微生物群中一種正常菌群，是院感常見菌群之一。在腸道生態失調和宿主免疫缺陷的條件下，這種菌體則變成機會性病原體，從而介導ALD的發生。目前，糞腸球菌對于大部分抗生素已產生較強的耐藥性，并且感染溶細胞性糞腸球菌的酒精性肝炎患者死亡率高達89%，因此重視糞腸球菌感染帶來的危害成為當下一個重要問題。因此，本文就糞腸球菌在ALD中的研究進展作一綜述。

1 ALD概述

ALD是世界最常見的肝病之一，也是當前世界范圍內肝硬化和肝臟相關死亡的主要原因之一［4-5］。根據全球疾病負擔項目統計，2016 年有1 256 900例患者死于肝硬化和慢性肝病。其中，334 900例（27%）患者與酒精相關。此外，有245 000例患者死于與酒精相關的肝細胞癌（HCC），占所有HCC相關死亡人數的 30%［6］。 將全球疾病負擔研究2010 的數據基于不同地區將酒精作為疾病或死亡風險因素建模，分析發現酒精引起的肝硬化相關死亡占所有肝硬化相關死亡人數的 47.9%［5］。而臨床上感染溶細胞素性糞腸球菌的酒精性肝炎患者中89%在入院后 180 天內死亡，其中72.2%死于肝衰竭及其相關并發癥［7］。

1.1 ALD病理特征 ALD的發生主要由酒精及代謝過程所致，酒精能夠導致腸道細胞損傷和腸上皮細胞死亡，降低Caco-2腸上皮細胞中緊密連接相關重要蛋白的mRNA，以及降低緊密連接蛋白，閉合蛋白和胞質緊密粘連蛋白1抗體（zonula occludens-1，ZO-1）的表達從而破壞腸道屏障，改變腸道的通透性。此外，酒精也能增加線粒體內活性氧的形成和降低線粒體谷胱甘肽GSH含量，使這些肝細胞進一步受到氧化損傷。由于腸道通透性的改變，腸道更容易發生細菌易位及其代謝產物的傳播，加上氧化應激損傷，從而誘導ALD的發生并加重進展為酒精性脂肪性肝炎［8］。

研究最新發現ALD發病中的一條新通路即FK506 結合蛋白 51 （FK506 binding protein 51，FKBP51）可以與 yes 相關蛋白 （Yes-associated protein，YAP） 上游激酶和哺乳動物 Ste20 樣激酶1相互作用，影響其和乙醇磷酸化 YAP 的能力，導致 YAP 核轉位和TEA域家族成員1（TEA domain family member 1，TEAD1）激活。 TEAD1的激活使其靶標CXC-趨化因子配體1（C-X-C ligand 1，CXCL1）的表達增加。CXCL1 是一種介導中性粒細胞募集趨化因子，能夠引起肝臟炎癥和中性粒細胞浸潤。而在感染溶細胞素性糞腸球菌的患者中CXCL1也呈高表達趨勢，從而參與ALD的進展。

1.2 ALD與腸道菌群關系 腸道是人體內最大的微生物庫，腸道及其微生物群（細菌和其他微生物）具有共生關系，其中85% 的微生物為細菌，大部分有助于消化、合成維生素和抵抗腸道病原體定植，但是致病微生物與共生微生物之間平衡失調能夠影響ALD的進展。如糞腸球菌，在長期飲酒者體內，由于腸道菌群生態失調、腸黏膜改變和腸道通透性增強，從而發生細菌易位并產生大量代謝產物，介導ALD的發生和進展［9］。

酒精性肝損傷的嚴重程度與 ALD 患者腸道內特定的微生物群特征相關，促進ALD患者肝損傷的細菌種類包括菌群失調的擬桿菌門以及Bilophila wadsworthia、Alistipes和 Escherichia Coli［10］。而存在于黏膜屏障中的Akkermansia muciniphila和產生丁酸的Prausnitzii具有抗炎和保護胃腸道黏膜的作用［11-12］。與ALD 相關的腸道微生物群還能使Muc2等粘蛋白、Reg3b和Reg3g表達下調，導致腸道菌群失調和細菌易位并增加黏附細菌的數量［13］。而ALD患者出現菌群生態失調，一方面能夠誘導腸道屏障損傷，促進脂多糖產生和其他病原體相關分子模式易位并加重肝臟炎癥損傷。如糞腸球菌攜帶的GelE基因，既是檢測其的標志物，也能改變腸道通透性，與糞腸球菌的肝臟定植增加相關［14］。此外，GelE基因也參與加工pro-基質金屬蛋白酶（MMP）-9 以激活 MMP-9，而活化的 MMP與糞腸球菌所產生的明膠酶也能改變腸道通透性［15］。另一方面，腸道部分革蘭陽性球菌產生相關的外毒素也會加重ALD的進展，如糞腸球菌的溶細胞素能夠直接導致肝細胞死亡和肝損傷［16］。由此可見，糞腸球菌及其代謝產物參與ALD發生發展的多個過程。

2 糞腸球菌與ALD的關系

腸球菌屬在大多數人類和動物的胃腸道中是天然定植菌，通常作為益生菌存在，但同時仍具有致病的潛力，如腸球菌導致的感染性心內膜炎［17］。腸球菌屬中的糞腸球菌是一種能夠通過依賴細胞骨架成分的侵襲途徑，進入哺乳動物細胞并在其中存活的細胞外細菌［18］。目前越來越多的證據表明腸道糞腸球菌能夠到達患者的肝臟，并通過脂磷壁酸在 HepG2 肝細胞中內化［19］。此外，Duan等［20］發現糞腸球菌在ALD患者腸道中大量增加，但酒精性肝炎的病死率與糞腸球菌的數量無關，而與分泌的溶細胞素相關。

2.1 糞腸球菌 腸球菌屬是一類人體內普遍存在的革蘭陽性球菌，與人類健康息息相關，是醫院相關性感染的主要病原體之一。糞腸球菌是腸道正常菌群，但其在機體免疫力下降時能夠發揮致病作用并且有極高的病死率，因此成為嚴重的醫療保健問題，例如糞腸球菌引起的感染性心內膜炎和尿路感染［21-23］。除此之外，糞腸球菌目前已經被確定為導致ALD肝損傷的病原菌之一［18］。糞腸球菌是一類革蘭陽性兼性厭氧，可形成不同長度鏈的橢圓形球菌。其基因組大小范圍約2.3～5.4 Mb，預測基因數量為 2 154～5 107 個，其中核心基因組的基因數量范圍為 605 ～1 037 個，但糞腸球菌的GC含量較低僅占34%～45%［24］。糞腸球菌對環境抗性強，在惡劣條件下（包括高鹽濃度）和寬溫度范圍（10? ℃～＞45? ℃）下具有生存的能力，并且對常見的防腐劑、消毒劑以及紫外線輻射也具有更強的抵抗力。糞腸球菌存在于自然界中多種宿主體內并且相互關聯，包括無脊椎動物、昆蟲和哺乳動物［23］。而在人類中，糞腸球菌是腸道最早最常見的定植菌之一，是正常腸道微生物組的重要組成部分，每克糞便中大約定植有1 011 個細菌株［25］。在20世紀80年代初開始出現多種抗生素耐藥的腸球菌菌株，現在已成為全球耐藥性細菌感染的主要原因。耐多藥糞腸球菌的基因組包含 25% 以上包括與耐藥性和毒力因子相關的可移動基因元件，這些移動基因元件可通過與信息素反應型質粒、結合質粒或結合轉座子相結合，從而在糞腸球菌之間傳播耐藥性和毒力相關基因［26］。

2.2 溶細胞素與ALD 溶細胞素是一種由高毒力的糞腸球菌菌株表達的成孔外毒素（是否產生溶細胞素是糞腸球菌的可變性狀［7］），其活性形式是由獨立基因 cylLL 和 cylLS12 編碼并翻譯后修飾的肽鏈CylLL 和 CylLS，對細菌和真核細胞具有溶解作用。在動物模型和臨床研究中發現溶細胞素與糞腸球菌的毒力呈正相關，在動物實驗中發現小鼠通過腹膜內注射含有編碼溶細胞素的質粒 pAD1 的糞腸球菌菌株，比非編碼溶細胞素的菌株毒力增強［7］。在人體內，研究［20］表明89%的溶細胞素陽性酒精性肝炎患者在入院后180 天內死亡（其中72.2%的患者死于肝衰竭）。一項回顧性研究［27］也表明，即使在控制了糞腸球菌的耐藥性并針對感染進行治療，溶細胞性糞腸球菌感染患者出現急性終末期結局（診斷后3周內死亡）的風險比非溶細胞性糞腸球菌感染患者增加了5倍。Garsin等［28］證實了在秀麗隱桿線蟲模型中，分泌溶細胞素的糞腸球菌具有更強的毒性，死亡率顯著升高。糞腸球菌的天然結合質粒除了編碼Cyl以外，還能產生一種名為 AS 的細胞表面蛋白，其可促進質粒轉移以及糞腸球菌與宿主組織相結合。但是，Cyl 是一種獨立的毒力因子，其介導的糞腸球菌對于秀麗隱桿線蟲殺傷作用與 AS 的存在與否無關。

2.3 糞腸球菌的免疫逃逸作用 溶細胞性糞腸球菌促進遠端器官感染引起發病，由于其裂解腸上皮細胞的能力使糞腸球菌能夠進入血流，從而定殖在遠處部位。此外，糞腸球菌能夠黏附于腸上皮細胞并刺激局部黏膜免疫，但不誘導炎癥信號傳遞［29］。這是因為糞腸球菌能夠裂解中性粒細胞和巨噬細胞，以及其分泌明膠酶（一種鋅金屬蛋白酶）和兩種莢膜多糖血清型（C 和 D）也有助于其完成逃避免疫監視等免疫反應［7，30-31］。而ALD患者在酒精的作用下會出現腸道屏障功能降低和菌群失調，加上糞腸球菌裂解細胞和免疫逃逸的能力，以至于糞腸球菌及其代謝產物更易透過腸道黏膜屏障，通過腸肝軸到達肝臟定植從而發揮致病作用。并且即使被多形核白細胞和巨噬細胞吞噬，糞腸球菌仍能夠抵抗其中的細胞內殺傷作用［32］。而巨噬細胞內的存活的糞腸球菌更易穿過腸上皮，導致糞腸球菌在全身傳播并定植［33］。但是，由TLR-5 和 IL-22 的信號通路所介導產生的免疫因子 RegⅢγ能夠抑制糞腸球菌在體內的生長和定植，其中IL-22信號通路已被證明在機體免疫糞腸球菌定植時起重要作用［34-35］。此外，糞腸球菌還能通過募集抗因子H抗體來逃避通過替代途徑激活的補體所介導殺傷作用［36］。

2.4 糞腸球菌介導ALD的機制 在長期大量飲用乙醇的小鼠模型實驗中，用溶細胞性糞腸球菌菌株［FA2-2（pAM714）］，非溶細胞性糞腸球菌菌株［FA2-2（pAM771）］和對照組PBS對小鼠進行灌胃，接受溶細胞性糞腸球菌灌胃的小鼠的病理和免疫組化檢測發現其轉氨酶、脂肪變性、炎癥和纖維化增加，IL1b、Cxcl1 和 Cxcl2等炎性因子和趨化因子呈高表達，這些指標均高于非溶細胞性糞腸球菌和PBS灌胃組。Cxcl1是ALD的生物標志物，通過 CXCR2 促進中性粒細胞浸潤到肝臟介導ALD的發展，并在FKBP5-YAP-TEAD1-CXCL1軸相關的ALD 發病機制中發揮重要作用［37-39］。因此發現，決定酒精性肝炎的嚴重程度和病死率的是產生溶細胞素的糞腸球菌量，而非患者體內所有糞腸球菌的數量。在對實驗室和臨床上與溶細胞素相關的參數進行單因素邏輯回歸分析，以及使用Cox 回歸分析評估溶細胞素與酒精性肝炎患者生存率的關系后，發現檢測ALD患者體內的溶細胞素，可以評估ALD相關進展結果和惡化死亡的預后情況，并且該指標比 MELD、ABIC 和DF等評分模型更能準確的預測病死率［20］。但通過16sRNA基因測序發現，無論是否為溶細胞性的糞腸球菌，均未顯著改變腸道微生物群的組成，也不影響乙醇在腸道的吸收或在肝臟的代謝。溶細胞素介導肝病發揮其毒性作用也并不依賴于乙醇，而是使肝細胞氣孔形成從而裂解死亡［7］。糞腸球菌還能誘導產生活性氧，損傷線粒體，從而參與酒精性肝炎的發病。除此以外，血凝素和脂肪酶在糞腸球菌的感染致病機制中也發揮了作用，但是具體機制尚待研究［40］。

3 糞腸球菌的檢測

糞腸球菌是過氧化氫酶陰性的革蘭陽性球菌，為目前醫院獲得性感染的常見細菌。臨床上對于該病原體的診斷方法通常包括核酸檢測、培養和生化分析的 PCR以及免疫學方法。目前，Nazari-Vanani等［41］制造了糞腸球菌DNA 生物傳感器用于量化細菌基因組，從而對人體樣本中的糞腸球菌檢測，為臨床診斷與檢測提供了新思路。此外，生物傳感器和分析裝置也能夠替代傳統檢查方式檢測檢測病原體［42］。

而溶細胞素陽性糞腸球菌的毒素是由獨立基因編碼，因此臨床上可以對CylLL和CylLS基因進行實時熒光定量PCR，以檢測患者體內糞腸球菌是否具由溶細胞性。其編碼CylLL的正向引物序列為5-CTGTTGCGGCGACAGCT-3，反向引物序列為5-CCACCAACCCAGCCACAA-3；而CylLS基因的正向引物為5-GTAAAATAAGTAAAATCAAGA-AAACTATTACTC-3，反向引物序列為5-CAAAAGAAGGACCAACAAGTTCTAATT-3 ［43］。

4 糞腸球菌的治療

糞腸球菌是目前第三常見的醫院感染病原體。在美國，2011—2014年糞腸球菌引起的醫院獲得性感染高達14% ，并呈持續上升趨勢［34］。糞腸球菌引起的手術部位感染、菌血癥、尿路感染和心內膜炎等對于萬古霉素等常規抗生素均已產生一定的耐藥性。其多種抗生素耐藥與功能性 CRISPR-Cas 系統的缺失密切相關［44］。目前臨床上主要使用氨芐青霉素和慶大霉素聯合用藥與氨芐青霉素和頭孢曲松聯合用藥治療糞腸球菌感染。但有研究［45］表明氨芐青霉素和頭孢曲松聯合用藥更安全。在臨床治療中，達巴萬星成功治療1例膿胸患者的糞腸球菌菌血癥，提示達巴萬星可能是臨床上治療糞腸球菌感染的新方案［46］。而對于多耐藥的糞腸球菌感染，干擾素γ與萬古霉素或慶大霉素的聯合使用能夠改善治療效果［47］。目前，臨床上對于耐多藥糞腸球菌感染最后選擇通常為替加環素，但一些菌株16SrRNA 位點或 30S 核糖體蛋白 S10 的突變導致對于替加環素產生耐藥性。因此，尋找新治療溶細胞素性糞腸球菌感染的方法成為當務之急［48］。

應用噬菌體替代抗生素治療感染是一個新方向。在既往研究中，噬菌體在胃腸道、泌尿道以及其他器官系統感染的患者中治療效果參差不齊，但明確了噬菌體治療能夠安全替代抗生素［49］。Duan等［20］發現在小鼠體內，針對糞腸球菌的特異性噬菌體可以誘導免疫反應并減輕酒精性相關疾病的炎癥、肝損傷和脂肪變性，并正在開展相應的臨床試驗。另一項研究［14］表明，終末期肝硬化患者的次級膽汁酸——脫氧膽酸（deoxycholanic acid，DCA）和石膽酸的濃度顯著低于健康人群。進一步研究發現，以DCA為主的次級膽汁酸的減少會增加糞腸球菌定植于肝臟的數量。因此，對于感染溶細胞性糞腸球菌的ALD患者而言，補充DCA是改善ALD進展的新方法。此外，由于糞腸球菌常在醫院環境中生長，菌體表面往往會形成一層生物膜，以保護其受到抗生素和外界環境的影響。而Tatta等［50］研究表明類萜類衍生物能夠有效防止生物膜形成，抑制糞腸球菌數量，因此具有開發為新型抗糞腸球菌藥物的潛力。此外，氣態臭氧和氫氧化鈣對于腸道的糞腸球菌具有抗菌作用，能夠減輕糞腸球菌及其代謝產物對于腸黏膜屏障和腸肝軸的影響，從而改善ALD［51-52］。

5 總結

ALD是全球最常見的酒精性相關疾病，主要是因為過量飲酒引起破壞黏膜屏障和腸道菌群生態失調，導致腸道通透性增加和細菌及其代謝產物通過腸系膜靜脈和門靜脈循環移位到達肝臟，從而產生氧化應激和內毒素血癥引起肝組織損傷。酒精也能使腸道菌群失調，導致革蘭陰性菌為主的部分腸道細菌種類升高以及易位，而這部分腸道細菌及其代謝產物能夠引起機體炎癥和內毒素血癥，進一步引起肝細胞死亡。而腸道菌群中的以糞腸球菌為代表的革蘭陽性菌分泌外毒素等細菌產物參與ALD的發病。因此，糞腸球菌的研究在防治ALD發揮著越來越重要的作用。

糞腸球菌是一種存在于人類腸道微生物群中的正常菌群。但在特定條件下，這種共生菌會變成導致ALD的病原菌之一。糞腸球菌能夠影響腸道黏膜屏障和腸肝軸，并且高毒力的糞腸球菌菌株可表達溶細胞素溶解細菌和真核細胞，在ALD進展中發揮重要作用。但是，目前關于糞腸球菌和ALD之間的具體分子機制仍然需要進一步探索。最后，由于糞腸球菌已成為一種耐多藥的醫院獲得性感染的病原體，因此尋找新的針對糞腸球菌感染的有效方法也是目前一項重要課題。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：

古镈源負責資料分析，撰寫論文；肖勝友、劉琛參與文獻收集與整理；程永浪負責論文修改；付文廣負責擬定課題設計、寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：

2022-10-16；錄用日期：2022-11-28

本文編輯：王亞南

引證本文：

GU BY， XIAO SY， LIU C， et al.

Research advances in the role of Enterococcus faecalis in alcoholic liver disease［J］. J Clin Hepatol， 2023， 39（7）： 1696-1702.

古镈源， 肖勝友， 劉琛，? 等.

糞腸球菌在酒精性肝病中的研究進展

［J］. 臨床肝膽病雜志， 2023， 39（7）： 1696-1702.