膽汁淤積性肝病動物模型構建的研究進展

張清清 曲穎 蔡曉波 陸倫根

摘要：

膽汁淤積性肝病（CLD）是一類由免疫、遺傳、環境等因素導致膽汁流動障礙，從而造成膽汁酸在肝臟和/或循環中的淤積的疾病。CLD發病機制尚未完全明確，且治療困難，動物模型作為人類疾病的替代對象，可以為探索疾病的病因病理及尋找合適的治療靶點提供平臺，本文就目前CLD動物模型的研究進展作一綜述。

關鍵詞：肝疾病； 膽汁淤積； 疾病模型， 動物

Research advances in animal models of cholestatic liver disease

ZHANG Qingqing， QU Ying， CAI Xiaobo， LU Lungen. （Department of Gastroenterology， The First Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200080， China）

Corresponding author：

LU Lungen， lungenlu1965@163.com （ORCID：0000-0002-1533-4068）

Abstract：

Cholestatic liver diseases （CLD） are a series of diseases due to impaired bile flow and accumulation of bile acid in the liver and/or systemic circulation caused by immune， genetic， and environmental factors. The pathogenesis of CLD remains unclear and CLD is difficult to treat. As a substitute for human diseases， animal models can provide a platform for exploring the etiology and pathogenesis of the disease and finding appropriate therapeutic targets. This article reviews the current research advances in the animal models of CLD.

Key words：

Liver Diseases； Cholestasis; Disease Models， Animal

膽汁淤積性肝病（cholestatic liver disease，CLD）是一類由免疫、遺傳、環境等因素導致膽汁形成、分泌和排泄障礙的肝膽疾病總稱。一項基于上海市慢性肝病的多中心流行病學研究［1］表明，在4 660例慢性肝病患者中，膽汁淤積的患病率為10.26%。CLD起病隱匿，臨床早期無明顯癥狀，進展期可出現黃疸、尿色加深、皮膚瘙癢等一系列高膽紅素血癥相關表現，可進一步發展為肝纖維化、肝硬化，甚至出現肝衰竭等終末事件。CLD根據發生部位可分為肝內膽汁淤積和肝外膽汁淤積［2］，包括膽道閉鎖（biliary atresia，BA）、膽石性肝病、藥物性膽汁淤積性肝病（drug-induced cholestasis，DIC）、妊娠期肝內膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）、IgG4性自身免疫性肝病、原發性膽汁性膽管炎（PBC）和原發性硬化性膽管炎（PSC）［3］。

CLD發病機制復雜，診斷困難，治療亟需解決。為了加深對CLD本身的認識，同時幫助臨床醫師在探究CLD機制和尋找新療法的研究中更科學、合理地選擇工具，本文就CLD的動物模型的制備、機制、優缺點作一綜述。

1 BA動物模型

BA是一種發生于嬰兒時期的肝臟內膽管異常狹窄、阻塞或者完全缺失的疾病，可導致膽汁淤積、膽道反復炎癥、膽管纖維化［4］。新生兒膽汁淤積癥患病率為1/2 500，約34%～43%為BA［5］。本病病因尚未明確，如不及時診治，可迅速進展至肝硬化、肝衰竭等終末期肝病而致死亡［6］。因此，對該病病因及發病機制的深入研究對于預防疾病尤為關鍵，而BA模型的構建是為其提供重要條件。

（1）膽總管結扎BA模型：2008年，國內學者張守華等［7］通過結扎5～6周齡BALB/c小鼠膽總管建立梗阻性黃疸模型，炎癥細胞變化與BA實際情況相符，術后剖腹可見近端膽總管囊性擴張，膽囊增大，肝臟呈淤膽性改變，但該模型存在以下缺陷：①成年小鼠的膽道系統已經發育成熟，與發生于嬰兒期的BA年齡不匹配；②臨床癥狀方面未很好地復現出BA的腹水等門靜脈高壓的并發癥；③病理組織學方面可見肝小葉結構模糊，膽汁淤積及大量增生的膽管，以及片狀壞死的肝細胞，但未見到肝內外膽管消失、肝纖維化甚至假小葉形成。而后國內學者葛軍濤等［８］對該模型進行改良，通過結扎新生BALB/c小鼠（出生后5～7天）的膽總管建立BA模型，術后2天出現黃疸、小便深黃、陶土樣大便、食欲不振、精神狀態差等癥狀，這與臨床上BA臨床癥狀有較為相似，術后10天左右出現實驗組小鼠死亡高峰期。該模型的優點在于造模方法相對簡單，重復性好，周期短，但也存在一些缺點：死亡小鼠解剖后可見增寬的膽總管、大膽囊，黃染的腸道及腎臟，但未見嚴重的肝硬化、門靜脈高壓、肝衰竭［3］等情況，這與臨床上患兒終末期表現不相符，其次該動物模型制備在小鼠出生后5～7天進行，無法完全模擬圍生期膽管閉鎖情況。

（2）毒素誘導BA模型：最初探索來源于1990年澳大利亞學者Harper和Kopp觀察到孕期進食了藻類等植物的牛羊，產下的幼崽在出生后大量死亡，臨床表現符合膽汁淤積癥狀，病理組織學表現為慢性肝損傷、肝纖維化、肝細胞壞死及肝硬化等情況，但限于當時醫學的局限性，未進行動物模型的探索［9-10］。2015年，國外學者［11］發現一種新型膽管損傷化合物“異黃酮、膽甾烯”，該化合物可造成斑馬魚幼蟲的肝外膽道系統的選擇性破壞。該團隊還發現斑馬魚基因組某個特定區域突變可增強該化合物的膽道毒性，可導致培養的新生小鼠肝外膽管細胞纖毛丟失，并破壞膽管細胞細胞極性和細胞膜的完整性。同時該團隊證實該區域與人類BA易感性位點具有高度同源性。這研究進一步證實了環境毒物在BA發生發展中的作用。2019年我國國內學者楊一凡等［12］建立膽閉素誘導斑馬魚BA模型，通過膽道排泄功能證實膽道毒性，并將造模成功的斑馬魚轉移至不含膽閉素的培養水中，發現其無法生存超過12天，這提示膽閉素誘導的膽道畸形是不可逆的，以上在一定程度上揭示環境毒素與BA發生的潛在關系，為BA的預防和輔助治療提供一定的思路，但目前基于哺乳動物的毒物誘導BA模型尚未報道，對于以上毒物對于膽管系統發育的具體影響尚未揭露，希望能進一步建立起與人類BA相近的動物模型。

（3）病毒誘導BA模型：目前有統一觀點認為各種宮內或圍產期感染是BA主要的病因，病毒感染觸發免疫反應，導致膽道進行性破壞［13］。基于以上觀點，學者建立了第一個小鼠模型，將恒河猴輪狀病毒接種到剛出生的小鼠身上，使肝外膽管出現類似BA的表現［14］。但不幸的是，這個模型有幾個實際的限制影響實驗的可重復性，包括病毒作用的時間和劑量，注射相關的腹部器官的損傷，以及菌株間的差異和模型的低存活率［15］。

2 膽石性肝病動物模型

膽石癥是膽道系統的一種常見病，成年人患病率為11%左右［16］。當膽汁的化學成分不平衡，膽固醇在膽汁中呈現過飽和狀態進而沉淀析出，則會形成膽結石［17］。其次在一些溶血性疾病中，紅細胞破壞程度異常高，導致膽紅素過量，進而形成膽石。此外，膽囊運動能力低下或收縮能力受損會影響膽囊內膽汁的有效清除，導致膽汁高度濃縮，最后發展為膽石癥［18］。早期Tepperman等［19］通過給小鼠喂食含有膽固醇-葉酸的飲食制備膽石癥模型，這種飲食包含高脂肪、高膽固醇和0.5%的膽酸。該研究表明膽酸與膽固醇的結合對于膽結石的形成是必不可少的，而單獨的膽固醇不能誘發膽結石。而后，多位學者［20-21］對不同種系的小鼠進行造模研究，揭示了Lith1和Lith2基因是膽結石易感性增加的主要原因。Wilund等［22］利用C57L/J小鼠飼以成石飲食研究耐力運動的抗結石效果，為耐力運動訓練可預防膽結石的觀點提供了證據。

3 DIC動物模型

DIC是以膽管細胞損傷為特征，臨床表現為黃疸、瘙癢、堿性磷酸酶升高的疾病。最近一項國內多中心流行病學調查［23］表明，在住院的藥物性肝損傷患者中，膽汁淤積型約占20.31%。

目前關于該病的發病機制及治療仍存在爭議，而動物模型的研究與開發是解決該問題的關鍵步驟。膽汁酸鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）是負責轉運膽汁酸鹽，定位于肝細胞膽小管側膜的一類ATP結合盒超家族蛋白。BSEP的抑制早先被認為是一個關鍵的分子啟動事件。藥物可通過抑制轉運蛋白活性、減少蛋白表達、改變其亞細胞定位、促進其突變，影響膽汁酸的轉運功能，從而影響膽汁酸的平衡［24］。基于以上基礎，有學者提出BSEP（Abcb11）-/-小鼠模型有助于闡述Bsep擾亂的連續影響，同時確定可能的膽汁酸運輸系統替代方式。該模型的一個缺點是出現輕度非進行性膽汁淤積，可能是由于小鼠的內源性膽汁酸與人類相比具有更強的親水性［25］。Wang等［26］提出可以通過給BSEP-/-小鼠注射額外的膽汁酸來解決以上的問題。

一些常見的肝損傷藥物也用于DIC模型的制備。氯丙嗪是世界衛生組織治療精神類疾病的基本藥物，但該藥物含有許多不良反應，其中包括膽汁淤積。目前氯丙嗪被認為是通過直接抑制BSEP來誘發膽汁淤積，同時抑制BSEP和MDR3（肝細胞基底側轉運蛋白）基因的表達，因該研究基于人的HepaRG細胞系，缺乏免疫細胞和其他的肝細胞的環境，且該細胞系來源于單一的男性捐贈者，同時細胞系的膽汁酸轉運體及膽汁酸合成能力有限，使這個模型有一定的局限［27］。國內學者［28］使用氯丙嗪大鼠腹腔內注射造模，大鼠血生化指標符合DIC變化，電鏡下見擴張的毛細膽管及淤膽樣改變，內質網擴張甚至崩解，線粒體腫大，小葉內及匯管區炎性細胞浸潤。該模型的缺陷在于：造模組存在死亡情況，藥物注射劑量需進一步調整。環孢素A用于防止器官移植后的移植物排斥反應。在環孢素A治療期間觀察到的最嚴重的副作用是腎臟毒性和肝臟毒性，肝臟毒性多表現為膽汁淤積并伴有低至中度高膽紅素血癥。與氯丙嗪類似，環孢素A處理的嚙齒動物也被廣泛用作DIC的實驗模型，考慮該藥物影響膜上的轉運蛋白及膜的流動性，但關于不同親水性膽汁酸是否對以上因素有影響無進一步研究［29］。

4 ICP動物模型

ICP是一種CLD，指是在懷孕的最后3個月，零星出現復發性黃疸、瘙癢、膽汁酸水平升高和/或ALT/AST升高，可導致胎兒不良結局，如早產、呼吸窘迫綜合征或死胎［30-31］。ICP發生的危險因素可能與遺傳、環境和激素等有關，但具體發生機制尚不清楚。目前研究最多的是ABCB4基因編碼MDR3蛋白，分布于肝細胞的毛細膽管面，在正常膽汁形成中存在重要作用，在ICP中，MDR3的突變達15%［29］。

此外，有研究表明雌激素在ICP的發生發展中起重要作用。ICP多發生在妊娠的最后3個月，此時雌激素水平達到最大值，其次與單胎妊娠相比，雌激素水平增加的雙胎和三胎妊娠ICP發生率更高。有ICP家族史或個人史的婦女在接受高劑量雌激素口服避孕藥治療時，更容易出現ICP［32］。已經確定的環境因素包括與血漿中硒含量增加有關的ICP發病率的增加，這在不同的季節里是不同的［33］。有研究［34］發現雌性激素，如雌二醇-17β-D-葡萄糖醛酸，是動物體內可逆性膽汁淤積的誘導劑。給嚙齒動物注射合成的炔雌醇或雌二醇-17βD-葡萄糖醛酸酯可用于研究ICP的基本機制。

5 PBC動物模型

PBC是一種針對肝內中小膽管的自身免疫反應引起的緩慢進展的CLD。該疾病的特點是免疫介導的肝內膽管的破壞和門靜脈炎癥。肝組織學特征包括早期的門靜脈炎癥，膽管周圍肉芽腫形成，肝門靜脈區嗜酸性粒細胞浸潤，選擇性中小膽管破壞，進而可發展為肝纖維化，甚至肝硬化［35］。PBC臨床表現多樣，可表現為瘙癢、乏力、黃疸、干燥綜合征、腹部不適、骨質疏松等，而典型表現為膽汁淤積的血清學表現和抗線粒體抗體（AMA）陽性［36］。

第一個創建的模擬PBC的模型包括帶有淋巴增生性（lpr）基因的MLL/lpr小鼠［37］。該基因導致嚴重的自身免疫性疾病，包括淋巴結病、高丙種球蛋白血癥、腎小球腎炎、關節炎和干燥綜合征等，且存在一定程度的AMA陽性，同時，MLL/lpr小鼠呈現出類似PBC的組織學特征如非化膿性破壞性膽管炎、膽管受損甚至缺失等。在這個模型中，研究者在肝臟中觀察到較高水平的MHC Ⅱ類表達，且門靜脈中CD4+ T淋巴細胞占主導位置，考慮以上因素促進自身免疫疾病的發展。該模型存在以下缺陷：（1）AMA陽性率不高，大約為50%；（2）MLL/lpr小鼠會出現與人類PBC臨床特征不相符的情況，包括血清膽紅素、肝酶存在明顯差異；（3）MLL/lpr小鼠并沒有存活到肝硬化階段，早期大部分因相關的腎病已死亡［38］。在此基礎上，Zhang等［38］學者對動物模型進行改進，創建了基于調節性T淋巴細胞（Treg）缺陷的Scurfy小鼠。Foxp3基因對Treg細胞的發育、維持和功能至關重要，而Scurfy小鼠存在該基因突變，導致Foxp3+ Treg細胞完全消失，進而全身免疫性疾病（如PBC）的易感性增加。該模型表現出與人類相符的血清學、免疫學和組織病理學特征，但其局限性在于免疫耐受破壞嚴重，壽命短，不利于對PBC發病過程及進展機制的研究［39］。另外，在白細胞介素2受體α（IL-2Rα）缺乏的基因敲除小鼠中，也取得了類似的疾病表型。IL-2Rα-/-小鼠表現出門靜脈淋巴細胞浸潤和細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2的數量增加，與PBC早期變化相近，該模型有利于研究其早期發病機制。該模型的缺陷在于沒有形成肉芽腫，并未發展成慢性膽汁淤積［40］。此后又有學者［41］開發了新的模型，通過引入Cl-/HCO-3陰離子交換蛋白2（AE2）基因失效的突變，來減少Treg細胞的數量。AE2參與胃質子分泌和分泌素刺激的膽道HCO-3的釋放，其紊亂對膽汁酸、胃酸平衡有影響。成熟的Ae2（a，b）-/-小鼠顯示出與PBC相似的免疫和肝膽變化，但同樣也有與PBC不同的改變，包括胃酸分泌受損和AMA偏低。非肥胖糖尿病（NODc3c4）小鼠可發展出一種類似于PBC的自身免疫性膽道疾病，具有相似的免疫學和血清學特征。然而，NODc3c4小鼠也表現出一些PBC的非特異性特征，包括膽道擴張和囊性病變，沒有出現慢性損傷性膽管炎。ARE-Del-/-小鼠的表型與人類PBC非常相似，尤其是在組織病理學、免疫學和血清學層面。與其他模型不同，這種小鼠模型是能體現出女性占優勢的情況，有益于闡明女性對PBC的易感性增加背后的關鍵機制［42］。

6 PSC動物模型

PSC是一種長期的慢性肝病，以肝內和/或肝外膽管的炎癥和纖維化為特征，導致多灶性膽管狹窄、慢性膽汁淤積，嚴重可進展為終末期肝病。臨床上可表現為右上腹痛、瘙癢、疲勞、黃疸、肝腫大和脾腫大。10%～20%的PSC患者會自發地發展成膽管癌［43］。Mdr2-/-小鼠是最早用于研究PSC的動物模型。Mdr2基因是人類MDR3（ABCB4）基因的同源物，編碼一種轉運器，可將磷脂通過管狀膜分泌到膽汁中。Mdr2基因突變可導致膽管上皮細胞損傷、膽管纖維化、硬化性膽管炎，與人類PSC組織學病變相似。Mdr2-/-小鼠模型的主要缺點是無法創建合并IBD模型和無法模擬人類PSC肝細胞癌的自發發展［44］。第二個模型是基于肝臟囊性纖維化跨膜轉運調節體（CFTR）的功能障礙會引發肝內膽管阻塞、膽汁淤積、膽管增生、肝纖維化的原理而創建的。研究［45］表明，Cftr-/-小鼠可發展為漸進性肝病，伴有局灶性膽管炎、漏出的膽汁和膽管增生。但Cftr-/-小鼠只表現出腸道表型，其他器官的病變輕微或不存在［46］，這與以上研究結果不相符。此外，Cftr-/-小鼠的這種腸道表型更類似于遠端腸梗阻綜合征和胎糞回流，而不是PSC的典型IBD表型［47］。因此，該模型很少被作為PSC的實驗模型。

紅細胞生成性原卟啉癥是一種遺傳性血紅蛋白合成疾病，該疾病帶來的鐵螯合酶活性降低容易導致膽管上皮損傷而導致膽道纖維化，出現嚴重的肝臟疾病。鐵螯合酶缺陷（fch/fch）小鼠表現為明顯的膽汁淤積表型，血清肝酶增加，膽汁酸鹽和原卟啉增加，在3個月內發生嚴重的肝纖維化并發展為肝硬化［48］。

α-萘基異硫氰酸酯（ANIT）是一種用于制備陽離子芳香族聚氨酯的化學品，它能充分誘導大鼠和小鼠的膽汁淤積，導致膽管上皮細胞損傷，進而導致肝細胞壞死。長期接觸ANIT會導致出現慢性膽管炎、膽管增生和膽管周圍纖維化的情況，以此出現了慢性ANIT模型［49］。3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫吡啶（DDC）是一種致卟啉劑和δ-氨基酮酸合成酶的強啟動劑，會誘發小膽管的阻塞，從而引發膽汁淤積。DDC誘導的膽汁淤積癥以硬化性膽管炎和明顯的膽汁纖維化為特征，且伴有導管增生，該動物模型制備簡易，較好地模擬PSC相關情況，對進一步探索PSC發病機制起關鍵作用［50］。因此，喂養嚙齒動物的DDC可用于研究（異物引起的）慢性膽管病。石膽酸是一種有毒的內源性膽汁酸，當存在異常高的濃度時也會誘發膽汁淤積。據此，石膽酸嚙齒動物模型可用于研究這種內源性膽汁酸的作用，以及了解膽汁酸在膽汁淤積癥發病機制中的潛在作用［51］。

7 結語

綜上所述，膽汁淤積是多種疾病過程中常見的病理改變，發病機制復雜，至今尚未完全闡明。基于此的模型是研究者探索其發病機制、研究治療方法的方向。目前動物模型存在一些問題：（1）種內差異。主要集中在造模菌種、動物模型性別以及年齡的差異。同樣的菌種在不同品系的動物中出現不同的表型，不同的動物性別以及年齡對于模型制備的敏感性不同。（2）種間差異。包括不同種間膽汁酸成分親水性不同，膽汁酸轉運體的底物特異性不同，代謝解毒存在差異等［45］。（3）除了種內種間差異之外，以上不同的動物模型各有其特有的缺點。因此，應充分認識每個模型的具體局限性，根據不同的研究目的來選擇適當的動物模型，并通過結合多種體內嚙齒動物模型來設計新的模型，從而規避局限性，努力建立一個低成本、方便操作、易于重復、病理改變與人類疾病相符的理想動物模型。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：張清清負責資料分析，查閱文獻，撰寫論文；曲穎、蔡曉波負責修改論文；陸倫根負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：

2022-10-13；錄用日期：2023-01-13

本文編輯：王亞南

引證本文：

ZHANG QQ， QU Y， CAI XB，? et al.

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