山茶種質資源的花腐病抗性評價

劉瑩　耿顯勝　俞文仙等

關鍵詞：山茶；種質資源；花腐病；抗性評價

中圖分類號：S763.15 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0157-08

山茶是山茶科（ Theaceae）山茶屬（Camellia）的常綠小喬木或灌木，被尊為中國十大傳統名花之一，栽培歷史1800多年，是世界著名的觀賞花卉，具有極高的觀賞價值，在城市綠化、庭院栽培、盆花生產等領域中得到廣泛應用。山茶屬植物絕大多數原產于中國，在日本、越南等地也有少數物種分布，在北美、歐洲、大洋洲（澳大利亞、新西蘭）等地區廣泛引種栽培。

山茶花腐病是由山茶葉杯菌（Ciborinia camelliae）引起的真菌性病害，該病嚴重影響山茶花的觀賞價值和經濟價值。山茶葉杯菌主要危害花朵，危害癥狀初期為褐色的斑點，后期蔓延至整朵花，致使受害花朵枯萎脫落。脫落后的花朵仍保持其形狀和硬度，后期在花瓣基部產生菌核，菌核在夏、秋季處于休眠狀態。翌年春天，隨著氣溫升高，菌核萌發，形成子囊盤和子囊孢子等有性世代的結構，子囊孢子成熟后從子囊盤內散發出來，借助風力傳播到健康的花朵上，進行新一輪侵染。山茶花腐病最早于1919年在日本被發現，后來美國、新西蘭和歐洲部分地區也陸續報道了該病害。鑒于其危害的嚴重性，以及其擴散和蔓延的普遍性，山茶葉杯菌在2003年被歐洲和地中海植物保護組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization， EPPO）列入A2類檢疫性有害生物，2013年被列入我國進境植物檢疫有害生物名錄。我國雖然僅有該病害零星發生的報道，但實際上該病已在山茶花重要產區擴散和蔓延，需引起高度重視。

新西蘭的研究人員在1999—2014年采用孢子接種法對部分山茶種質資源進行了花腐病的抗性評價，但評價的種質資源多為國外品種且數量有限，我國絕大多數種質資源的抗性水平尚不明確。本研究擬確定接菌后適宜的抗性評價時間點，制定山茶花腐病病情嚴重度分級標準和抗性評判標準，建立山茶種質資源花腐病抗性評價技術，篩選出高抗花腐病的山茶種質資源，研究結果為制定高效、安全的山茶花腐病的防控措施提供依據。

1材料和方法

1.1材料

委托中國工業微生物菌種保藏中心從荷蘭烏特勒支的微生物菌種保藏中心（Centraalbureauvoor Schimmelcultures，CBS）訂購花腐病的病原菌山茶葉杯菌（C.came Hiae，編號CBS 101527）。

本研究評價的56份山茶種質資源來源于中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所國家山茶種質資源庫（RISF）、金華市國際山茶物種園國家山茶種質資源庫（JHICS）、浙江金華茶花苗圃（JHCNS）和肇慶棕櫚谷花園有限公司生產基地（PETC）。

1.2山茶花腐病抗性評價適宜時間點的確定

將山茶葉杯菌轉接到PDA平板上，20℃下培養15 d，用無菌打孔器從菌落的邊緣打取直徑為5mm的菌絲塊，作為接種體。取無病蟲害、無損傷、剛開放的攸縣油茶（Camellia yuhsienensis Hance）、單體紅山茶（C.uraku Kitamura）和皺果茶（C.rhytidocarpa Chang et S.Y. Liang）的離體花瓣作為試驗材料，每種山茶取30片花瓣，設置3個重復，每個重復10片花瓣。用無菌昆蟲針在花瓣的中央刺6個針孔，在針孔處接上接種體，接菌后的花瓣擺放在鋪有無菌濕潤濾紙的培養皿中，培養皿置于人工氣候箱內培養。人工氣候箱培養條件設置為：溫度20℃，濕度80%，光照強度4000 Lx，光周期12 L：12 D。試驗以接種無菌水的離體花瓣為對照處理組。

接菌后0、24、48、72和96 h，分別觀察接菌組和對照組花瓣的發病情況，使用單反相機（SELP1650 SONY CORP）拍照。使用ImageJ軟件測量病斑面積和花瓣的總面積，計算病斑的相對面積，依據病斑相對面積確定抗性評價適宜的時間點。

1.3山茶花腐病病情嚴重度分級標準和抗性評判標準的制定

采集無病蟲害、無損傷、剛開放的山茶花朵，采用1.2中的方法準備花瓣樣品并接種山茶葉杯菌菌絲塊，接菌后72 h，使用單反相機拍照記錄試驗結果。采用Image J軟件測量病斑面積和花瓣面積，計算病斑相對面積。

采用SPSS 23.0對所有測定樣品的病斑相對面積值做頻次分布統計。參考謝藝賢等病害抗性評價的分級標準，依據本研究中不同山茶種質資源病斑相對面積的頻次分布數據，制定山茶花腐病病情嚴重度分級標準（表1）。

接菌后72 h的山茶花瓣，采用病情嚴重度分級標準確定其發病級別，計算山茶種質資源的病情指數（Disease index，DI）。依據病情指數的大小制定山茶種質資源花腐病抗性評判標準（表2）。

1.4山茶種質資源資源花腐病抗性的評價

從1.1中描述的4個地點采集無病蟲害、無損傷、剛開放的山茶種質資源的花朵，立即帶回實驗室，用于種質資源的抗性評價。采用1.2中描述的方法準備花瓣樣品并接種山茶葉杯菌的菌絲塊，人工氣候箱內培養72 h后，拍照記錄每片花瓣的發病情況。測量并計算病斑的相對面積，采用制定的病情嚴重度分級標準確定每片花瓣的發病級別，計算每份種質資源的病情指數，依據制定的抗性評判標準評判每份種質資源的抗性水平。病情指數

DI的計算公式如下：

式中，DI為病情指數；R_i為病害級別；T_j為病害級別的花瓣數；9為最高病害級別；～為某份種質資源調查的花瓣總數。

2結果與分析

2.1山茶花腐病抗性評價適宜時間點的確定

從接種后花瓣病害癥狀來看，不同山茶種質資源對花腐病的抗性存在明顯的差異。攸縣油茶接種后0～96 h均未出現病斑，單體紅山茶和皺果茶在接菌后0～24 h同樣未觀察到病斑，但隨著時間的增加，病斑開始擴展（表3）。通過比較3份山茶種質資源在接菌后相同培養時間的病斑相對面積，發現在接菌后Oh和24 h，3份種質資源均未出現病斑，無法通過病斑的相對面積將它們的抗性水平區分開來；接菌后48 h，攸縣油茶和皺果茶的病斑相對面積均為0.00%，也無法通過病斑相對面積將這兩者的抗性水平區分開來；接菌后72 h和96 h，均是單體紅山茶病斑相對面積明顯大于皺果茶病斑相對面積，皺果茶病斑相對面積明顯大于攸縣油茶的病斑相對面積，即這2個時間點都能夠通過病斑的相對面積將3份山茶種質資源的抗性水平區分開來。但是，接菌后72 h單體紅山茶病斑相對面積是相同時間點皺果茶病斑相對面積的30.23倍，明顯高于接菌后96 h單體紅山茶和皺果茶病斑相對面積的比值，即在該時間點3份山茶種質資源的抗性水平區分最好。基于以上結果，本研究確定接菌后72 h為抗性評價的適宜時間點。

2.2不同山茶種質資源花腐病抗性的評價

山茶種質資源的病情指數和抗病水平分析發現，不同山茶種質資源花腐病的抗性存在明顯差異，攸縣油茶的病情指數最小，為0.00，其對花腐病抗性水平為免疫，單體紅山茶的病情指數最大，高達55.93，其對花腐病抗性水平為高感（表4）。本研究評價的56份山茶種質資源中，免疫和高抗種質資源共8份，占參試種質資源的比例為14.29%，包括攸縣油茶、大花紅山茶（C.magnif/ora Chang）、‘彩丹、杜鵑紅山茶、‘葡萄酒、皺果茶、‘迷茫的春天和‘夏夢文清；中抗種質資源24份，占參試種質資源的比例為42.86%，包括‘愛麗牡丹王‘山崎大錦‘夏日七心、崇左金花茶（C.chuangtsoensis S.Y.Liang et L.D.Huang）、長尾紅山茶（C.longicaudata Chang et S.Y. Liang）、‘春江虹蕊、浙江紅山茶（C.chekiangoleosa Hu）、‘花牡丹‘菊冬至等；中感種質資源14份，占參試種質資源的比例為25.00%，包括‘夏夢華林‘園林之嬌、越南油茶（C.vietnamensis T.C.Huang ex Hu）、‘夏日衍平‘富士之峰‘春節、博白大果茶（C.gigantocarpaHu et Huang）等；高感種質資源10份，占參試種質資源的比例為17.86%，包括‘伊豆立寒、中東金花茶（C.achrysantha Chang et S.Y.Liang）、‘小玫瑰、單體紅山茶、紅皮糙果茶（C.crapnellianaTutch）、金花茶（C.nitidissima Chi）等表4）。

本研究評價了山茶屬短柱茶組（Sect.Paracamellia）、瘤果茶組（Sect.Tuberculata）、紅山茶組（Sect.Camellia）、油茶組（Sect.Oleifera）、古茶組（Sect.Archecamellia）、金花茶組（Sect. Chrysantha）和糙果茶組（Sect. Furfuracea）共7組的種質資源，這7個組的平均病情指數依次為0.00、1.85、13.25、16.57、25.56、29.63和35.19。短柱茶組和瘤果茶組的抗性最強，表現為免疫和高抗；紅山茶組的抗性較強，表現為中抗；油茶組抗性水平較弱，表現為中度感病；古茶組、金花茶組和糙果茶組的抗性最弱，都表現為高感花腐病。

同一組內不同種間的抗性水平也存在差異。紅山茶組雖然總體抗性水平為中抗，但是在該組中既有高抗的大花紅山茶、‘彩丹‘杜鵑紅山茶、‘迷茫的春天和‘夏夢文清，也有中抗的‘夏日七心‘丹心、浙江紅山茶等種質資源，還有高感花腐病的‘夏夢岳婷‘喬伊和單體紅山茶；油茶組總體抗性水平為中感，但油茶組中也有高抗品種‘葡萄酒，并且還有中抗的‘山崎大錦‘梅之風‘白九重‘厚禮‘千代鶴‘榮光等種質資源；金花茶組總體抗性水平為高感，但該組內也有中抗種質資源崇左金花茶（表4）。

在同一親本的不同雜交組合中，雜交品種的抗性也表現不同。以杜鵑紅山茶為親本的雜交品種中，‘夏夢文清（杜鵑紅山茶ב帕克斯先生）、‘夏日七心（杜鵑紅山茶ב帕克斯先生）、‘夏夢華林（紅山茶品種‘都鳥×杜鵑紅山茶）、‘園林之嬌（杜鵑紅山茶×紅山茶品種‘達婷）、‘夏日衍平（‘媚麗×杜鵑紅山茶）和‘夏夢岳婷（‘客來邸×杜鵑紅山茶）的病情指數分別為4.81、5.56、15.93、18.89、19.26和27.41。‘夏夢文清表現為高抗花腐病，‘夏日七心表現為中抗花腐病，‘夏夢華林‘園林之嬌和‘夏日衍平表現為中感花腐病，‘夏夢岳婷表現為高感花腐病（表4）。與親本杜鵑紅山茶相比，除了‘夏夢文清外，其它5個雜交品種的抗花腐病的水平均有所降低，表明雜交品種的抗性水平發生分離，可能是雙親親本共同影響子代的抗病性。

3討論

種質資源的抗病性是以植物物理和化學因子為基礎，減輕或克服病原物致害作用的一類特性。實踐表明，利用種質資源的抗病性防控病害是高效、安全的防控措施。我國具有極為豐富的山茶種質資源，眾多的山茶種質資源為抗病育種提供了豐富的候選種質資源。本研究對我國華東和華南地區收集和保存的山茶種質資源開展花腐病的抗性評價，研究結果有助于明確山茶種質資源花腐病的抗性水平，為利用種質資源的抗病性防控花腐病提供基礎。

國外花腐病抗性評價工作起步早，Taylor于1999年首次采用氣傳子囊孢子接種法評價了78份山茶種質資源對花腐病的抗性，初步明確了抗病和感病種質資源，發現10份中抗花腐病的種質資源，包括攸縣油茶、尖連蕊茶（C.cuspidata Wright ex Gard），川滇連蕊茶（C.longicarpaChang），五柱滇山茶（C.yunnanensis Cohen）和‘春霧等。2004年，Taylor在1999年的抗性評價的基礎上，比較了不同接種方法和接種后不同時間點對抗性評價的影響，發現氣傳子囊孢子接種法優于孢子懸浮液接種法，確定接菌后72h為適宜的抗性評價時間點。另外，該研究還鑒定出了13份高抗種質資源，包括攸縣油茶及以攸縣油茶為親本的雜交種、玫瑰連蕊茶（C.rosaefloraHooker）、五柱滇山茶（C.yunnanensis Cohen）、臺灣連蕊茶（C.lutchuensis Wright ex Gard）等。2013年，Denton-Giles等采用病斑相對面積、乳突有無、胞間H₂O₂、初生菌絲的相對數量等多個指標，綜合評價了短柱茶組、連蕊茶組（Sect. Theopsis）、紅山茶組和實果茶組（Sect.Stereocarpus）內40份物種及1份雜交種對花腐病的抗性，發現短柱茶組中的攸縣油茶、連蕊茶組的臺灣連蕊茶和南投禿連蕊茶（C.transnokoensis Hayata）為高抗種質資源，占總評價種質資源的7.32%。以上抗性評價都是采用子囊孢子作為接種體進行抗性鑒定，子囊孢子接種雖在一定程度上模擬自然侵染過程，但山茶葉杯菌不能夠在人工培養基上產生子囊孢子，田間收集子囊孢子難度大，且孢子質量難以控制。本研究采用菌絲塊作為接種體進行抗性評價，結果表明，菌絲塊能夠在較短的時間內引起山茶花瓣發病，并且通過病斑相對面積能夠將不同抗性水平的種質資源區分開來，故山茶葉杯菌的菌絲塊也能夠作為接種體用于種質資源的抗病性評價。本研究采用3份抗性不同的種質資源設置時間梯度，比較了接菌后不同培養時間對抗性評價的影響，確定接菌后72 h為適宜的評價時間點，該研究結果與Taylor采用子囊孢子接種時的結果一致。

本研究以病斑相對面積為測量指標，制定了山茶花腐病病情嚴重度分級標準和抗性評判標準，建立了山茶花腐病抗性評價技術體系，評價了56份山茶種質資源花腐病的抗性，明確了8份為免疫或高抗花腐病種質資源、24份為中抗種質資源、14份為中感種質資源、10份為高感種質資源。在8份免疫或高抗花腐病種質資源中，攸縣油茶的抗性最強，這與Taylor和Denton-Giles等的研究結果一致。攸縣油茶原產于我國，具有濃烈花香味、耐瘠薄、果實出仁率高、果油率高等優點，并且該物種還抗花腐病和炭疽病，因此攸縣油茶可以作為優質抗源用于花腐病和炭疽病的抗性育種。杜鵑紅山茶是山茶屬特有的珍稀瀕危物種，該物種的自然種群僅分布于廣東省陽春市。杜鵑紅山茶是夏季和秋季開花的物種，而夏、秋季節山茶葉杯菌處于不活躍狀態，因此杜鵑紅山茶能夠避免被山茶葉杯菌侵染，具有避病性。本研究室內抗性評價結果表明，杜鵑紅山茶以及以杜鵑紅山茶為親本的雜交品種‘夏夢文清對花腐病的抗性水平都為高抗，因此杜鵑紅山茶也可作為優質抗源用于花腐病的抗性育種。

4結論

本研究比較了接種山茶葉杯菌后不同培養時間對抗性評價的影響，確定接種菌絲塊于山茶種質資源的離體花瓣，并在接菌后72 h統計病斑的相對面積，能有效地對山茶種質資源進行抗病性評價。本研究制定了山茶花腐病病情嚴重度分級標準和抗性評判標準，建立了一套山茶花腐病抗性評價技術，應用該技術對我國華東和華南地區收集和保存的56份山茶種質資源開展花腐病的抗性評價，明確這56份山茶種質資源花腐病的抗性水平，分析了山茶屬不同組間、同一組內不同種間以及同一親本的不同雜交組合之間抗病性的差異性，篩選出了攸縣油茶、大花紅山茶、‘彩丹、杜鵑紅山茶、‘葡萄酒、皺果茶、‘迷茫的春天和‘夏夢文清8份免疫或高抗花腐病的山茶種質資源。研究結果為制訂高效、安全的山茶花腐病的防控措施提供理論依據。