基于UHPLC_QTOF-MS技術的五倍子單寧成分分析 倪冰冰 劉宏 于立洋等

關鍵詞：五倍子；沒食子單寧；超高效液相色譜一四極桿飛行時間一質譜；裂解規律

中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1498（2023）01-0011-11

五倍子（Chinese gallnut）是五倍子蚜蟲（Melaphis chinensis）寄生引起植物葉變態發育形成的蟲癭。依據2020版《中華人民共和國藥典》對五倍子的描述，漆樹科植物鹽膚木（Rhuschinensis Mill.）、青麩楊（R.potaninn Maxim）、紅麩楊（R.punjabensis J.L.Stewart ex Brandis）是五倍子蚜蟲的寄生樹種。五倍子可被分為角倍和肚倍，角倍蚜（Sch/echtenda/ia chinensis Bell）在鹽膚木上寄生形成的蟲癭被稱作角倍。五倍子是我國重要的創匯林業資源，水解單寧含量豐富，可達到五倍子干質量的74.79%，縮合單寧最高可達到五倍子干質量的1.92%。五倍子中富含的單寧類多酚化合物，具備抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒和神經保護等多種生物學效用，在醫學、印染、制革、化工等方面應用廣泛。

水解單寧通常被分為沒食子單寧和鞣花單寧。上世紀初，研究學者便開展了對沒食子單寧結構及組分的研究，沒食子單寧的中心葡萄糖可連接1至12個沒食子酰基基團，形成沒食子酰基葡萄糖（Galloylglucose，GG）。1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖（PGG）具備5個沒食子酰基，PGG結構上的沒食子酰基結合1個新的沒食子酰基，這兩個沒食子酰基則形成二沒食子酰基基團（圖1），增加1個沒食子酰基基團的PGG被稱為六沒食子酰基葡萄糖（圖1），PGG結構上的沒食子酰基結合兩個新的沒食子酰基，則形成三沒食子酰基基團（圖1），增加兩個沒食子酰基的PGG被稱為七沒食子酰基葡萄糖，通過形成多個二沒食子酰基基團和三沒食子酰基基團，PGG可生成高分子質量的“復雜沒食子單寧”。PGG結構上的兩個沒食子酰基之間以C-C鍵連接，生成特征基團六羥基二苯（ HHDP），則形成鞣花單寧（圖1）。

單寧的分子質量最高可達20000 Da，大量的酚羥基也易發生氧化水解反應。除此之外，不同沒食子單寧之間結構性質相似，為五倍子單寧成分分析帶來了挑戰。有研究表明，使用蒸餾水提取五倍子化合物成分后，將提取液溶解于95%乙醇溶液，HPLC-TOF-MS技術可檢測到1-GG至3-GG，以及大量的單寧同分異構體。一種基于UHPLC-MS/MS的技術，使用沸水回流的方法提取五倍子粉末，在提取液中鑒定到1-GG至8-GG。一種基于HPLC-ESI-MS的方法，使用100℃水溶液提取五倍子，在提取液中鑒定到1-GG至8-GG。基質輔助解析，電離-飛行時間-質譜（MALDI-TOF-MS）在高分子質量化合物的電離上有一定優勢，有研究考察了陽離子化試劑對MALDI-TOF-MS技術鑒定五倍子單寧的影響，在購買的分析試劑級五倍子提取物中，鑒定到3-GG至14-GG，然而，該方法未能分離單寧的同分異構體。目前，五倍子單寧成分的分析，沒有統一的標準和方法，很多研究不能全面地鑒定高分子質量的沒食子單寧。超高效液相色譜一四極桿飛行時間-質譜聯用技術（UHPLC-QTOF-MS）具備優越的分離和定性鑒別能力，該技術可被用來鑒定水解單寧、黃酮類等多酚化合物，是植物活性成分分離和表征的重要分析手段。依據前人的研究基礎，本實驗以-80℃凍存的角倍和烘干處理的角倍為材料，采用高溫提取和超聲波輔助提取2種提取方式，選用乙醇、水和丙酮3種不同的提取溶劑，基于UHPLC-QTOF-MS技術對五倍子單寧成分進行測定、并探討單寧的裂解規律，以期為五倍子中活性物質的開發提供實驗依據。

1材料與儀器

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 供試材料為鹽膚木葉翅上著生的角倍，于2020年8月采于湖北省宜昌市五峰縣。角倍采摘后進行清洗，并清除角倍內蚜蟲及雜質，液氮速凍后保存在-80℃超低溫冰箱，另一部分角倍放于烘箱內，105℃殺青30 min，之后80℃烘干至質量恒定。

1.1.2化學試劑 乙醇、丙酮、甲酸（色譜純）購自Sigma公司；乙腈購自Honeywell公司；質譜級超純水（18.2MQ-cm）由Milli-Q水凈化系統制備。

1.1.3標準品 沒食子酸甲酯（CAS： 99-24-1）、鞣花酸（CAS：476-66-4）購自普西堂生物有限公司，單寧酸（CAS：1401-55-4）、PGG（CAS：14937-32-7）、沒食子酸（CAS：149-91-7）購自索萊寶生物有限公司。

1.2試驗儀器

試驗儀器為Agilent6560Q UHPLC-Q-TOF液質聯用系統，美國Agilent公司；PoroshellSB-AqC18（2.1×100 mm，2.7μm）色譜柱，美國Agllent公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；CPA224S電子天平，德國Sartorius公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；Milli-Q水凈化系統，德國MerckKGaA公司。

2研究方法

2.1進樣溶液的制備

2.1.1單寧成分的提取 使用液氮研磨冷凍保存的角倍樣本，研磨后的粉末過60目篩，稱取均質后的五倍子粉末0.100 g；

將0.100g五倍子粉末分散于50mL純水，放人高壓蒸汽滅菌鍋（121℃）提取30 min，濾紙過濾后重復提取30 min；

將0.100g五倍子粉末分散于50mL純水，超聲波提取，提取功率1500W，提取30min，過濾后重復提取30min；提取溫度65℃。

將以上提取液放置室溫后，使用超純水定容至100mL，0.22 pm濾膜過濾后獲得待測液。

2.1.2標準品溶液的制備 稱取PGG、鞣花酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸和單寧酸，分別使用超純水配制為1.00 mg.mL^-1的標準溶液，用來作對照品溶液，輔助化學物質的鑒定。

2.2 UHPLC-QTOF-MS條件

2.2.1 色譜條件 柱溫35℃，進針體積5μL。流動相為0.1%甲酸水溶液（A），乙腈（B）。流速：0.3 mL.min^-1。梯度洗脫程序為0～5 min，98%A; 5～8 min， 90%A; 8～40 min，75%A;40～45min，10%A；保持5 min，后運行4 min停止。

2.2.2質譜條件 離子源為ESI負離子源；掃描質量數范圍為m/z 100～3200；干燥氣溫度320℃；干燥氣流速8 L.min^-1；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速12L·min^-1；霧化器壓力40 psi；毛細管電壓負離子3500 V；去簇電壓380 V；采集模式為Full scan Auto MS/MS。

2.3數據分析

UHPLC-QTOF-MS技術能夠提供測定物質的精確分子質量和離子裂解碎片信息。在總離子流圖的基礎上，由提取離子流圖和一級高分辨率質譜信息獲得相應化合物的保留時間和精確的分子質量，使用軟件對采集到的酚類化合物進行定性，產生化合物相應的分子式。獲得化合物的特征裂解碎片信息后結合標準品及文獻報道數據進行鑒定，并推測化合物可能的裂解途徑。使用Chem Draw 20.0和Adobe Illustrator 2021軟件進行化合物結構圖的繪制。

3結果與分析

3.1五倍子單寧成分的鑒定

本試驗關注的有效物質為多酚類化合物，負離子模式響應效果優于正離子模式。因此，選擇負離子ESI進行電離。對五倍子的提取溶液進樣分析，得到了負離子模式下的總離子流圖（圖2）。基于目標化合物的保留時間和高分辨率質譜數據，結合標準品及查閱文獻進行確定。在高溫121℃提取條件下，干五倍子和凍存五倍子提取液中均只鑒定到1-GG至8-GG，而在超聲波輔助提取條件下，五倍子水提取液中均檢測到1-GG至14-GG。除此之外，還檢測到沒食子酸、間雙沒食子酸、鞣花酸、橡碗酸二內酯、兒茶素及沒食子酸甲酯。

3.1.1超聲波65℃提取條件下五倍子化合物的鑒定在超聲波輔助提取條件下均鑒定到了14種沒食子單寧，65℃水浴條件下鑒定到最多的單寧異構體，其中，2-GG檢測到8個異構體（圖3），3-GG檢測到5個異構體，鞣花酸檢測到5個異構體，4-GG檢測到4個異構體，7-GG、9-GG、11-GG、12-GG分別檢測到2個異構體（表1）。而在60℃和55℃條件下，僅3-GG和4-GG檢測到異構體。

表1中的編號與總離子流色譜圖中圖A的編號相對應，編號為2的準分子離子峰為m/z331[M-H]^-，確定該化合物的分子質量為332 Da，產生了m/z271[M-H-60]^-、m/z169[M-H-162]^-的裂解碎片，其中，母離子脫去一個特征性的葡萄糖苷（162 Da）得到m/z169碎片離子，表明該物質結構包含一個沒食子酸的取代基，結合文獻數據推測該化合物為1-GG，1-GG的裂解規律主要體現在糖苷的損失及C2H20（60 Da）的特定中性損失。

編號為3、5、6、8、9、11、13、14的化合物準分子離子峰為m/z483[M-H]^-，確定其分子質量為484 Da，主要裂解離子為m/z313[M-H-170]^-、m/z271[M-H-170-42l^-、m/z211 [M-H-170-42-60l-、m/z169[M-H-170-42 -60 -42]^-、m/z151[M-H-170-42-60-42-18]^-、m/z125.0243[M-H -170-42-60-42-18-44]^-，m/z169的裂解離子表明該化合物存在沒食子酸取代結構，m/z125的特征碎片離子是由沒食子酸脫去一個羧基（44 Da）形成的。該化合物的裂解規律主要體現在沒食子酸（170 Da）、羧基、H20 （18 Da）、C2H20 （60 Da）及42 Da的中性損失。化合物12、16、17、19、20的準分子離子峰為m/z635[M-H]^-，確定其分子質量為636 Da，該化合物典型碎片離子有m/z617[M-H-18]^-、m/z483[M-H-152]^-、m/z465[M-H-18-152]^-、m/z331[M-H-152-152]^-、m/z313[M-H-18 -152-152]^-及m/z271、m/z211、m/z169、m/z125等特征性裂解碎片，mz/152的特征性損失是化合物脫去一個沒食子酰基（152 Da）形成的。該化合物的裂解規律主要體現在沒食子酰基的連續損失及水分子的損失。結合文獻數據，這兩種化合物分別鑒定為2-GG和3-GG。

編號為18、21、22、23的化合物準分子離子峰為m/z787，化合物32的準分子離子峰為m/z469[M-2H]^2-，兩者特征裂解碎片主要表現出沒食子酰基和水的損失，并產生了特征性碎片離子m/z169、m/z125。結合文獻數據，將兩種化合物鑒定為4-GG和PGG。對于PGG，m/z787碎片離子是由母離子脫去一個沒食子酰基形成的，繼續損失一個沒食子酰基則生成m/z635碎片，再丟失一個水分子形成m/z617碎片，之后失去一個沒食子酰基，則生成m/z465離子碎片，也可能由m/z635丟失沒食子酸形成的（圖4）。

編號為30的化合物準分子離子為m/z1 091[M-H]^-，化合物33、34的準分子離子峰為m/zl243[M-H]^-，并在碰撞過程中連續失去沒食子酰基。化合物36的準分子離子峰為m/z1395[M-H]^-，經活化碰撞產生了裂解碎片m/z1 243[M-H-152]^-、m/z1 091[M-H-152-152]^-、m/z621[M-2H-152]^2-、m/z545[M-2H-152-152]^2-。結合文獻信息，這3種化合物被推定為6-GG、7-GG和8-GG。化合物26的準分子離子峰為m/z773[M_2H]^2-、化合物38的準分子離子峰為1547[M-H]^-，兩者的分子質量均為1548 Da；化合物27的準分子離子峰為849[M-2H]^2-，化合物39的準分子離子峰為m/z1 699[M-H]^-、確定兩者的分子質量均為1700Da。化合物35的準分子離子峰為m/z925[M-2H]^2-，確定該物質的分子質量為1852 Da，二級質譜顯示它們都具備特征性的沒食子酰基的丟失情況，這3種化合物分別被推定為9-GG、10-GG和11-GG。化合物40的準分子離子峰為m/z1001[M-2H]^2-、確定其分子質量為2004 Da，并產生了m/z1 699[M-H-152-152]^-、m/z1 395[M-H-152-152-152-152]^-及m/z301和m/z183.030等特征性裂解離子，被鑒定為12-GG。化合物41的準分子離子峰為為m/z1 077[M-2H]^2-、確定其分子質量為2 156 Da，化合物42的準分子離子峰為m/z1 153[M-2H]^2-、確定其分子質量為2 308Da，兩者產生了m/z925、m/z301、m/z183等特征性裂解離子，被推定為12-GG、13-GG和14-GG。

3.1.2高溫提取條件下五倍子化合物的鑒定 在高溫121℃條件下，烘干的五倍子和凍存的五倍子水提取溶液中都只能鑒定到1-GG至8-GG，其中3-GG鑒定到5個同分異構體，PGG鑒定到4個同分異構體，1-GG、4-GG、6-GG、7-GG均鑒定到2個同分異構體（表2）。表2中的編號與總離子流色譜圖中圖B的編號相對應。

值得注意的是，不同分子質量的沒食子單寧之間存在規律的m/z152的差值，與化合物結構間相差一個沒食子酰基（152 Da）相吻合，特定沒食子酰基的中性損失是該類化合物的特征之一。

3.2其他化合物的鑒定

負離子模式下，鑒定到其他類化合物共6個。其中，沒食子酸、鞣花酸、沒食子酸甲酯是與標準品品比對確定的。表1中編號為1、10的化合物準分子離子峰為m/z469[M-H]^-，并檢測到碎片離子m/z451[M-H-18]^2-、m/z425[M-H-44]^-、m/z407[M-H-44-18]^2-，該化合物的碎片離子主要依賴于水分子和羧基的損失，結合文獻鑒定為橡碗酸二內酯。化合物4被鑒定為沒食子酸，該化合物在負離子模式下產生m/z169[M-H]^-的準分子離子峰，羧基鍵能較弱，容易發生斷裂，形成穩定性高的m/z125[M-H-44]-離子，之后，m/z125[M-H-44]-脫去一個水分子形成m/z107[M-H-44-18]^-，損失一個CO后形成m/z79[M-H-44-18-28]。化合物15的準分子離子峰為m/z321、對應的分子質量為322 Da，產生特征裂解碎片m/z169、m/z125和m/z79，參照文獻數據，推定為間雙沒食子酸。化合物7、24、25、31、43的準分子離子峰為m/z301[M-H]^-，化合物7的特征裂解離子有m/z169、m/z151、m/z123、m/z107，除此之外，其他4個化合物的裂解離子為m/z283、m/z257、m/z229、m/z185、m/z145，結合文獻數據鑒定為鞣花酸。

4討論

解析五倍子中的化合物質成分，是五倍子進一步開發利用的基礎。然而，單寧組成成分復雜，分子質量大，鑒定到高度沒食子酰基化的單寧較為困難。據報道，乙醇、水、乙醇-水溶液、丙酮、丙酮水溶液、甲醇、乙酸乙酯都是提取植物單寧成分的良好溶劑。基于不同的提取溶劑對單寧提取效率的影響，選定了3種提取溶劑，丙酮、乙醇和水，提取方式為高溫高壓提取，分別采用了烘干的角倍樣本和-80℃冷凍保存的角倍樣本，經過高分辨質譜分析，獲得的提取物中包含相似的單寧組分，主要為1-GG至8-GG。然而，經過大量的實驗分析，均未鑒定到高分子質量的沒食子單寧組分。

超聲波輔助提取可顯著減少處理時間，降低提取溫度，具備更高的提取效率，是提取水解單寧的有效方法，本研究采用了超聲波輔助提取方法，在五倍子水提取物中成功鑒定到了1-GG至14-GG。除此之外，考察了3種不同超聲提取溫度下五倍子水提取物的單寧成分。在55℃、60℃和65℃超聲提取條件下，五倍子水提取物均含有1-GG至14-GG。其中，在65℃條件下，五倍子水提取物中包含最多的沒食子單寧異構體，可能是因為溫度的升高，有利于有效物質的溶解。有研究使用蒸餾水為提取溶劑，提取時間為20h，在五倍子提取液中鑒定到1-GG至3-GG。一種使用沸水回流提取的方法，提取時間為3h，在五倍子水提取液中鑒定到1-GG至8-GG。本研究基于超聲波輔助提取方法，提取時間為1h，在五倍子水提取液中測定到14種沒食子單寧（表1）。本研究基于高分辨質譜技術，建立了一種有效的鑒定方法，在超聲輔助的五倍子水提取液中檢測到了高分子質量的單寧成分及大量的單寧同分異構體。

在五倍子提取物的高分辨質譜分析過程中，沒食子單寧呈現規律的沒食子酰基和沒食子酸的丟失情況。[M-H-152]-或[M-H-170]^-基峰離子的形成，表明沒食子單寧中氧苷鍵的兩種特征性斷裂行為。一些碎片離子由糖苷丟失產生，沒食子單寧中的氧苷鍵容易斷裂，通過葡萄糖的交叉環切除反應，引起了C₂H₄O₂（60 Da）的丟失，并伴隨著H₂O和羧基的損失。除此之外，沒食子單寧及其同分異構體會產生較為一致的裂解離子。[M-H-152-18-152]-、[M-H-152-18-152-152]-是由于沒食子酰基和水分子的相繼損失，[M-H-152-152]^-是由于沒食子酰基的相繼損失。對于PGG，同分異構體之間顯示出不同的裂解模式。除了本實驗中推測的裂解途徑外，PGG還可以裂解為m/z769[M-170]^-、m/z617[M-170 -152]^-、m/z465[M-170-152-152]^-、m/z313[[M-170-152-152-152]^-，主要是通過沒食子酸和沒食子酰基的連續損失進行裂解。

5結論

超聲波輔助提取方法能夠有效地提取五倍子中的水解類單寧物質，利用UHPLC-QTOF-MS技術分析五倍子中的單寧成分，成功檢測到了1-GG至14-GG及大量的沒食子單寧異構體。五倍子單寧主要通過沒食子酸（C₇H₆O₅）、沒食子酰基（C₇H₄O₄）、H₂O、羧基、糖苷、60 Da和42 Da的中性損失進行裂解。該方法能夠有效的鑒定到五倍子中的活性物質，質譜裂解模式可應用于其他植物中沒食子單寧及其同系物的快速解析，本研究為植物中單寧成分的研究與開發提供科學依據。