九葉青花椒葉綠體基因組結構及系統進化分析

劉霞　孫沖　黃勤琴等

關鍵詞：高通量測序；花椒屬；葉綠體基因組；九葉青花椒；系統進化

中圖分類號：S718.46 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1498（2023）01-0100-09

九葉青花椒（Zanthoxylum armatum'Jiuyeqing'）為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum L.）竹葉花椒的主要栽培品種，具有矮化、豐產、質優、抗逆等優良特性，其果實清香，麻味純正，備受消費者喜愛，市場需求旺盛。我國花椒屬植物的基礎研究十分薄弱，花椒屬物種間的系統發育關系尚待進一步解析。

長期以來，國內外有關花椒屬植物的研究大都集中在其化學成分的提取和分離，以及提取物種所具有的生物活性和相應的藥用價值方面，僅有少數學者基于少量的核基因（ETS和ITS）、葉綠體基因（rps16和trnL-trnF）、分子標記（SSR、RAPD和SRAP）開展了花椒屬內幾個物種間的親緣關系研究。但基于單個片段或分子標記其有效信息位點不足，花椒屬內物種間的系統位置支持率不高，花椒屬內種間系統進化關系未能很好的解析。因此，解析九葉青花椒的葉綠體基因組結構特征與系統進化關系，為花椒種質資源的分子鑒定、品種選育和農藝經濟性狀的遺傳分析具有重要意義，亦為花椒屬系統進化研究提供依據。

葉綠體是植物進行光合作用的重要細胞器，在植物生長發育過程中具有重要作用。葉綠體基因組一般具有保守的四分體結構，即包括大單拷貝區（Large Single Copy，LSC），小單拷貝區（SmallSingle Copy，SSC），2個反向重復區（Inverted Repeat Region，IRs）。大多數被子植物葉綠體基因組為母系遺傳，且葉綠體基因組的核苷酸替換率適中，因此，葉綠體基因組是進行系統進化和分化時間分析的理想標記。近年來，隨著葉綠體基因組測序成本降低，使其在植物系統進化分析中廣泛應用。本研究利用高通量測序技術進行主栽品種九葉青花椒葉綠體全基因組測序，通過組裝、拼接和注釋得到其全長葉綠體基因組序列，并對其葉綠體基因組結構、組成及系統進化關系進行分析，旨在豐富花椒的遺傳信息，為未來研究花椒屬植物間的系統進化、親緣關系及品種鑒定提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

九葉青花椒葉片采于重慶文理學院特色植物研究院花椒示范基地，植物標本（2021023jyq）放置于重慶文理學院園林與生命科學學院標本館。采用改良CTAB法對九葉青花椒提取基因組DNA，-20℃冰箱保存，備用。

1.2試驗方法

1.2.1葉綠體基因組測序和注釋 利用提取的DNA構建shotgun文庫，并在BGISEQ-500平臺（中國，廣州）進行測序。PE150雙末端測序得到raw data，過濾掉低質量序列后得到reads進行拼接組裝。使用SOAPnuke軟件進行質量控制后，以花椒（Zanthouxylum bungeanum Maxim.）的葉綠體基因組作為參考，用SPAdes v3.13.0軟件組裝葉綠體基因組。基因組注釋采用GeSeq（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.ht-ml）軟件。注釋后的葉綠體基因組序列提交至GenBank數據庫中。

1.2.2葉綠體基因組結構組成分析 九葉青葉綠體基因組序列的GC含量采用Editseq v7.1.0軟件計算，OGDRAW軟件制作九葉青花椒葉綠體基因組圖譜。CodonW v.1.4.2軟件分析相對密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU），研究其偏好性。

1.2.3重復序列預測 通過Tandem Repeats Finder（https：//tandem.bu.edu/trf/trf.html）搜.尋基因組序列中的串聯重復序列，用REPuter（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer/）在線服務分析葉綠體基因組中的重復序列（正向、反向、回文和互補重復），采用MISA （https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）在線預測九葉青花椒葉綠體基因組包含的簡單重復序列（Simple Sequence Reapeat，SSR），其中，一、二、三、四、五、六堿基重復的檢測標準分別設置為10，6，5，5，5，5。2個SSR之間的最小距離設置為100 bp，小于100 bp時，2個微衛星組成1個復合微衛星。

1.2.4系統進化分析 從NCBI上下載得到12個蕓香科物種的完整葉綠體基因組序列，將這些葉綠體基因組序列與本研究得到的九葉青花椒的完整葉綠體基因組序列通過MAFFT軟件進行比對分析，其中黃檗（PheHodendron amurense Rupr.）和川黃檗（Phellodendron chinense Schneid.）的葉綠體基因組序列作為外類群。采用RAxML軟件構建ML（Maximum Likelihood）樹，建樹過程中通過GTR模型確定最優樹。MrBayes3.1.2軟件構建Bl（Bayesian）樹，采用GTR替代模型和伽馬分布率，每1000代進行1次計算。

2結果與分析

2.1九葉青花椒葉綠體全基因組結構及特征

注釋組裝獲得九葉青花椒完整的葉綠體基因組圖譜見圖1。該葉綠體基因組序列全長158 579 bp，包括大單拷貝區域（LSC）長85 780 bp，小單拷貝區域（SSC）長17 603 bp，2個反向重復區（IRa和IRb）相等長度為27 598 bp。共注釋了133個基因，其中，88個蛋白編碼基因，37個tRNA基因和8個rRNA基因。葉綠體基因組總的GC含量為38.5%，IR區域（42.5%）的GC含量明顯高于LSC區域（36.8%）和SSC區域（33.6%），這可能主要是IR區域具有高GC含量的rRNA基因造成的。在注釋的九葉青花椒葉綠體基因組中18個特異基因具有內含子，包括12個特異編碼基因和6個特異tRNA基因。除pafl具有2個內含子外，其余均具有1個內含子。rps12基因被截斷為2個片段，其中，1個外顯子位于LSC區域，另外2個外顯子位于IR區域。最長內含子位于trnK-UUU基因，長2503 bp，主要是因為內部包含matK基因；rps12基因內含子最短（538 bp）。

2.2九葉青花椒葉綠體基因組的重復序列和簡單重復序列分析

通過軟件測算在九葉青花椒葉綠體基因組中存在19個串聯重復序列，其中，長度最大為25bp，最小為14 bp，長度為18bp的重復序列最多，有6個。該葉綠體基因組中共檢測到長片段重復序列49個，其中，21個正向重復，8個反向重復，19個回文重復和1個互補重復（圖2）。重復長度范圍為19～50 bp，其中，長度為20 bp的重復最多（10個），其次是19 bp（9個），而重復長度為26、31、48、50 bp的最少，均1個。在九葉青花椒葉綠體基因組中共預測到70個SSR，包括60個單核苷酸，1個二核苷酸，9個復合型SSR（表1）。75.7%的SSR位于IGS和內含子等非編碼區域且A/T堿基在SSR中出現頻率較高，在60個單核苷酸SSR中，包含A堿基SSR有26個，包含T堿基SSR有32個。從表1可以看出，SSR在葉綠體基因組中分布隨機，表明SSR數量豐富，遺傳信息含量高，可篩選具有多態性的引物，為未來研究花椒種群遺傳多樣性和遺傳結構提供參考。

2.3密碼子偏好性分析

在九葉青花椒葉綠體基因組中的蛋白編碼基因共有26398個密碼子（不包括終止密碼子），其中，亮氨酸Leu的密碼子最豐富（2821個），占總數的10.69%，編碼Leu的6種同義密碼子中TTA數量最多；編碼半胱氨酸Cys的數量最少（310個），僅占密碼子總數的1.17%。通過對密碼子使用頻率的計算結果表明：編碼異亮氨酸lle的ATT（1078）使用次數最多，編碼甲硫氨酸Met的ATT （1）和GTG （2）的使用次數最少。相對同義密碼子使用率值（RSCU）受影響密碼子使用模式的突變因子的影響，因此，RSCU<1表示密碼子使用率較低，RSCU>1表示密碼子使用率較高，RSCU=1表示無偏倚。經計算分析，相對同義密碼子使用值（RSCU）的范圍為0.005（ATT）到2.986（ATG），分析還發現RSCU>1的密碼子有31種，說明這些密碼子有一定的偏好性。在這些密碼子中，29個以A或T結尾，僅2個以G結尾，這說明九葉青花椒在密碼子第三位堿基上有較強的A/T堿基偏好性。由圖3可以看出：編碼精氨酸Arg、亮氨酸Leu和絲氨酸Ser密碼子種類最多，有6種密碼子編碼。色氨酸Trp不存在密碼子偏好性（RSCU=1），只有1個密碼子（TGG）編碼。

2.4基于葉綠體基因組序列的系統進化分析

以黃檗和川黃檗2個黃檗屬植物為外類群，連同花椒屬11個植物的全葉綠體基因組序列構建ML和Bl系統進化樹，2種方法得到的拓撲結構基本一致，僅在個別分支節點支持率上略有差別。從圖4可看出：花椒屬物種聚為一支，2種方法在分支上的支持率均為100%，為單系類群。Z.panicu/-atum和Z.madagascariense位于分支基部與其他花椒物種構成姊妹群關系，且分支支持率為100%和1（ML和BI）。狹葉花椒、青花椒和Z.pinnatum聚為一個分支與Z.tragodes、胡椒木、花椒、Z.sp. NH-2018、野花椒和九葉青花椒形成的分支構成姊妹群關系，分支支持率均為100%，其中，九葉青花椒與野花椒呈姊妹關系，親緣關系最近，與花椒（Z.bungeanum）親緣關系相對較遠。

3討論

在大多數的被子植物中，葉綠體基因組具有典型的四分體結構，序列長度一般為120～160kb。九葉青花椒葉綠體基因組同樣具有相同的序列結構特征，其葉綠體基因組總長度為158 579 bp，其中，LSC長85 780 bp，SSC長17 603 bp，IRs長度為27 598 bp，總的GC含量為38.5%，IR區域（42.5%）的GC含量明顯高于LSC區域（36.8%）和SSC區域（33.6%），這主要是因為IR區域具有高GC含量的rRNA基因造成的。

九葉青花椒葉綠體基因組中的蛋白編碼基因共有26 398個密碼子，在31種RSCU>1的密碼子中，除了TTG和ATG外，其余密碼子均以A或T結尾，這說明了九葉青花椒在密碼子的使用偏向于第三個密碼子位置為A和T，有較強的A/T堿基偏好性。研究結果與蒺藜苜蓿（Medicagotruncatu/a Gaertn.）、杓蘭（Cypripedium calceo/us L.）、和馬尾松（Pinus massonianaLamb.）等植物葉綠體基因的第3位密碼子偏好性趨勢相吻合，但與酸棗（Ziziphus jujuba var.Spinosa （Bunge） Hu ex H.F.Chow）、陸地棉（Gossypium hirsutum L.）和樟樹（Cinnamomum camphora （L.） Presl）等植物的葉綠體基因分析結果不同。這表明密碼子使用偏好性在不同物種中存在一定的差異。

葉綠體SSR是研究群體遺傳學、生物地理學和系統進化等高效的分子標記，在大量研究中廣泛應用。在九葉青花椒葉綠體基因組SSR預測中，絕大多數為單堿基重復（60/70），這與肖蒲桃（Syzygium acuminatissimum （Blume）Candolle）、胡桃（Juglans regia L.）和金錢槭（Dipteronia sinensis Oliv.）等大多數植物研究結果一致。重復序列的分析為將來青花椒品種及其他植物的物種鑒定和個體水平的遺傳差異分析提供了豐富的遺傳信息支撐。

我國花椒屬物種繁多，品種較多，為該屬的物種、品種鑒定帶來極大困難。本研究基于葉綠體基因組序列得到的花椒屬系統進化結果與Appelhans等利用葉綠體基因片段和核基因片段構建的進化樹結果一致，花椒屬物種均聚為一個分支，形成單系類群，這與Feng等的研究結果一致。花椒屬物種形成2大分支，即崖椒亞屬和花椒亞屬2大分支，這與傳統的分類學結果一致。本研究表明，九葉青花椒與野花椒親緣關系較近，與北方主栽花椒親緣關系相對較遠，這與Feng等的研究結果一致。但由于花椒屬物種較多，目前提交到數據庫中的葉綠體基因組序列有限，基于葉綠體基因組序列構建花椒屬的系統進化關系還不夠全面，將來需獲取更多花椒屬物種的數據來全面分析物種間的系統進化關系。

4結論

本研究利用高通量測序技術，組裝和注釋了九葉青花椒完整的葉綠體基因組，并解析了該基因組的結構特征和系統進化關系，結果表明，九葉青花椒葉綠體基因組的結構特征與其他花椒屬植物相似，為典型的四分體組成結構，全長序列為158579bp，編碼133個基因，26 398個密碼子，檢測到19個串聯重復序列，49個長片段重復、70個簡單重復序列。系統進化關系分析表明，花椒屬為單系類群，九葉青花椒與野花椒關系密切。研究結果可為未來研究花椒種群遺傳多樣性和遺傳結構提供參考。