一株產低溫堿性淀粉酶蕈狀芽孢桿菌的分離篩選和發酵優化

劉佳慧 呂紅 林娟

本研究的目的是從生態環境獨特而復雜的西藏林芝地區的土壤樣品中挖掘所蘊藏的特殊淀粉酶微生物資源.采用淀粉酶功能篩選的方法獲得一株低溫堿性淀粉酶生產菌株，編號為3F1.其酶活最適條件為10 ℃、pH 10.2.通過16S rDNA序列分析法鑒定該菌株為蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides），并將其命名為Bm3F1.通過發酵條件的逐步優化，最終確定其最佳發酵條件為：發酵培養基中添加1.5%可溶性淀粉，培養基初始pH 7.2，裝液量10 mL/250 mL，菌體接種量9.0%，發酵溫度30 ℃，發酵時間18 h，經優化后可將菌株的酶活提升至13.58 U/mL. 表明從西藏林芝地區分離的Bm3F1具有在低溫和堿性條件下產較高酶活淀粉酶的特性.

低溫堿性淀粉酶; 蕈狀芽孢桿菌; 分離篩選; 發酵條件優化

Q93A2023.026001

收稿日期： 2022-05-09

基金項目： 上海市科技攻關項目 （19DZ2282100）; 西藏大學-復旦大學生物多樣性與全球變化聯合實驗室資助項目

作者簡介： 劉佳慧 （1997- ）， 女， 上海人， 碩士研究生， 研究方向為微生物活性物質挖掘. E-mail： 19210700068@fudan.edu.cn

通訊作者： 林娟. E-mail： linjuan@fudan.edu.cn; 呂紅. E-mail： honglv@fudan.edu.cn

Isolation and screening of psychrophilic and alkaline amylase-producing Bacillus mycoides strain 3F1 and the optimum fermentation for enzyme production

LIU Jia-Hui， L Hong， LIN Juan

（School of Life Science， State Key Laboratory of Genetic Engineering， Tibet University-Fudan University Joint Laboratory for Biodiversity and Global Change， Fudan University， Shanghai 200438， China）

This study is intended to explore the microbial resource contained in the soil samples of Nyingchi， Tibet， which has a unique and complex ecological environment. A psychrophilic and alkaline amylase-producing strain was obtained by the amylase functional screening method， numbered 3F1. The optimum conditions of amylase activity were 10 ℃ and pH 10.2. According to the 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis result， this strain was classified as Bacillus mycoides and named Bm3F1. Through the gradual optimization of fermentation conditions， the optimum fermentation condition for Bm3F1 was determined as follows： fermentation medium was supplemented with 1.5% soluble starch， the initial pH was 7.2， the liquid volume was 10 mL/250 mL， the bacterial inoculum was 9.0%， and the fermentation temperature and time were 30 ℃ and 18 hours， respectively. Under the optimum conditions， the amylase activity from Bm3F1 could be increased to 13.58 U/mL. The results showed that Bm3F1 isolated from Nyingchi， Tibet， has the characteristics of producing high activity amylase under low temperature and alkaline conditions.

Psychrophilic and alkaline amylase; Bacillus mycoides; Isolation and screening; Fermentation condition optimization

1 引 言

淀粉酶全稱為葡聚糖水解酶，屬于一種水解酶類，能催化淀粉、糖原和糊精等多糖化合物中的糖苷鍵，將其水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖.在淀粉為原料的工業生產中，淀粉酶作為最重要的一種水解酶，可參與液化（liquefaction）和糖化（saccharification）等加工過程.例如生淀粉降解酶（Raw starch degrading enzymes， RSDE）在淀粉糊化階段可直接用于降解生淀粉顆粒，具有顯著的節省能源和簡化工序等效益［1］.目前淀粉酶已經成為用途最廣、產量最大的一種酶制劑，占整個酶制劑市場的30%，可用于食品飼料加工、燃料酒精工業、紡織退漿過程、生物制藥等等行業［2， 3］.

微生物發酵法作為目前淀粉酶大規模生產的主要途徑.其發酵方式主要分為深層發酵法（Submerged fermentation， SmF）和固態基質發酵法（Solid substrate fermentation， SSF）.前者適于細菌發酵生產，后者適于真菌發酵生產［4］.工業上廣泛使用的細菌來源淀粉酶主要來自芽孢桿菌屬（Bacillus），如枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. 1icheniformis）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus）、凝結芽孢桿菌（B. coagulans）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和嗜堿芽孢桿菌（B. alkalophilic）等.在真菌來源淀粉酶方面，曲霉屬（Aspergillus）中的米曲菌（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）、泡盛曲霉（A. awamori）、煙曲霉（A. fumigatus）、黃曲霉（A. flavus）和白曲霉（A. kawachii），以及青霉菌屬（Penicillium）中的擴展青霉（P. expansum）、微紫青霉（P. janthinellum）、棕褐青霉（P. brunneum）、婁地青霉（P. roqueforti）、癭青霉（P. fellutanum）、沙門柏干酪青霉（P. camemberti）、產黃青霉（P. chrysogenum）和奧爾森青霉（P. olsonii）等都可作為淀粉酶生產的真菌來源［4， 5］.

雖然目前研究顯示具有分泌胞外淀粉酶的生產菌株眾多，但是特定性能淀粉酶生產菌株則相當有限.這些淀粉酶在特殊反應條件下如高溫、低溫或強酸、強堿等處理下依然能夠保持較高的酶活.這較常規淀粉酶具有更為廣闊的應用前景.例如，嗜冷交替單胞菌（Alteromonas haloplanctis）所生產的低溫淀粉酶（AHA）具有高靈活性的多肽鏈可在較低溫度條件下（0～20 ℃）進行酶促反應［6， 7］.此類在低溫條件下仍具有較高酶活的淀粉酶，在生物工程領域可用于解決現代能源危機，具有較高的應用經濟價值［8］.另外，堿性淀粉酶可以耐受強堿環境，在環境pH值為 8.0～10.0時仍具有催化活性.該特性具有抵抗惡劣的工業加工條件，使其在工業應用中展現出較好的優越性.由于當下具有各種特性的淀粉酶生產菌株大多都是從特殊或極端的自然環境樣本中進行篩選和獲取的，故而本研究選取生態環境獨特而復雜的西藏林芝地區作為采樣地，通過挖掘當地所蘊藏的微生物資源，期望篩選獲得具有良好特性的產淀粉酶菌株.在此基礎上通過一系列的發酵條件優化提高生產菌株的產酶量，以最終實現當地微生物資源由簡單發現到高值化應用的轉換.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 樣品來源 樣品采自西藏林芝市波密縣如納村的玉米作物土壤.在采集時去除2 cm的表土后取距離地面2～15 cm土層的混合樣裝入樣品袋，于4 ℃保存.

2.1.2 培養基 ?種子和發酵培養基：胰酪胨17.0 g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L， pH值調至7.3±0.2;

淀粉酶篩選培養基［9］：可溶性淀粉2.0 g/L，胰酪胨15.0 g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L， pH值調至7.3±0.2.

2.2 方 法

2.2.1 淀粉酶生產菌株的篩選 稱取2 g土壤樣品裝入盛有22.5 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩后靜置15～20 min作為原始菌液.待上清液與沉淀分層后，吸取上清液制備成10-1、10-2和10-3三個濃度梯度的稀釋液.分別吸取100 μL稀釋液涂布于淀粉酶篩選培養基平板上，于28 ℃倒置培養，每隔16 h觀察一次菌落生長情況，待長出明顯菌落后采用碘熏蒸法［10］進行淀粉酶生產菌落的顯色初篩.選擇具有明顯透明水解圈的菌落轉接至淀粉酶篩選培養基上進行劃線分離，于28 ℃培養16 h后用碘熏蒸法進行驗證與復篩，用以獲得形狀、大小、顏色相一致的純種單菌落［11， 12］.挑取單菌落接種于含有1 mL種子培養基的2 mL EP管中，于28 ℃、220 r/min條件下培養16 h后進行編號作為后續實驗的種子液.

2.2.2 初始發酵培養 將種子液以1.0%接種量接種于含有5 mL發酵培養基的15 mL試管中，培養基初始pH 7.3±0.2，于28 ℃、220 r/min培養16 h.發酵結束后，取2 mL發酵液于12 000 r/min離心20 min后吸取上清液作為粗酶液進行酶活測定.

2.2.3 淀粉酶活力的測定 測定方法：采用3， 5-二硝基水楊酸法，即DNS法測定淀粉酶的酶活［13， 14］.取80 μL粗酶液與720 μL 1.0%可溶性淀粉溶液（用20 mmol/L、pH 5.2的醋酸鈉緩沖液配制）混合，在28 ℃、pH 5.2條件下反應15 min后，迅速加入800 μL的DNS顯色劑，沸水浴10 min后用冰水混合物冷卻至穩定.在540 nm波長下測定吸光值，以去離子水作為空白對照組，并且每個樣品做三個平行組.

最適反應溫度測定條件：在pH 5.2條件下設定五個反應溫度值（4、10、28、50和65 ℃），以確定酶活的最適溫度.

最適pH的測定條件：在28 ℃條件下設定五個反應pH值（3.2、4.2、5.2、9.2、10.2和11.2），以確定酶活的最適pH.

酶活計算：一個酶活單位（U）定義為：在酶活測定條件下，1 mL粗酶液每分鐘產生相當于1 μmol/L葡萄糖所需要的酶量.

酶活計算公式如下：

酶活=A×V1×103t×V2×180（μmol·L-1/mL·min）

式中，A是水解產生葡萄糖濃度（mg/mL）;V1是反應總體積（mL）;103是單位換算倍數;t是反應時間（min）;V2是粗酶液體積（mL）;180為葡萄糖分子量.

2.2.4 菌株鑒定 形態學觀察：在淀粉酶篩選培養基平板上觀察菌落形態特征，挑取單菌落進行革蘭氏染色后在100倍光學顯微鏡下觀察菌體形態特征.

生理生化指標鑒定：挑取純培養的單菌落進行一些系列的細菌生理生化試驗，如過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原性試驗和Voges-Proskauer （V-P）試驗，具體實驗流程可參考《常見細菌系統鑒定手冊》［15］.

分子生物學鑒定：采用16S rDNA基因測序法進行細菌的種屬鑒定，利用通用引物（27-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492-R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和Vazyme 2× Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶進行PCR擴增.取5 μL擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統下觀察1500 bp左右的目標條帶.將成功擴增的樣品進行測序，其測序結果通過GeneBank數據庫（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和EzBioCloud數據庫（https：//www.ezbiocloud.net/identify）進行序列比對以確定種屬［16］.

2.2.5 發酵條件優化 發酵優化采用的是逐步優化的方法，初始發酵培養條件與2.2.2所述相同，酶活測定條件為在2.2.3中確定的最適溫度和pH條件下測定.

（1） 發酵時間的優化

在初始發酵培養條件下，改變發酵時間，每隔6h進行無菌取樣測定細菌濃度（OD600），通過觀察菌株的生長及產酶曲線，以確定該菌株的產酶模型以及最佳發酵時間.

（2） 培養基作用底物類型和濃度的優化

在（1）的基礎上，在發酵培養基中添加不同作用底物類型（可溶性淀粉、普魯蘭多糖、蔗糖、麥芽糖），底物質量濃度均為10 g/L;選取最適底物類型，通過改變最適底物濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%），確定最適底物濃度.

（3） 培養基初始pH的優化

在（1）和（2）的基礎上，通過改變培養基初始pH值（4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2和10.2），以確定最佳初始pH;

（4） 裝液量的優化

在（1）（2）（3）的基礎上，在250mL三角瓶中分別加入不同的培養基裝液量（3、10、25、50、100和150 mL），以確定最佳裝液量.

（5） 發酵溫度的優化

在（1）（2）（3）（4）的基礎上，分別于不同溫度條件（20、25、30、35、40和45 ℃）進行培養，以確定最佳發酵溫度;

（6） 菌體接種量的優化

在（1）（2）（3）（4）（5）的基礎上，改變菌體接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%），以確定最佳接種量.

3 結果與分析

3.1 低溫堿性淀粉酶生產菌株的篩選和鑒定

從采集到的土壤樣品中，通過功能活性篩選法在248個可培養單菌落中分離得到24株可在其菌落周圍形成明顯水解圈的淀粉酶生產菌株.產淀粉酶菌株占總菌株的9.68%.通過探究溫度和pH對分離菌株酶活的影響，獲得一株在低溫和堿性條件下仍具有較高淀粉酶活性的菌株，其編號為3F1.測定結果如圖1所示，在pH 5.2條件下，其酶活在10 ℃時可達最高值，約為0.79 U/mL（圖1A）;在28 ℃條件下，其酶活在pH 10.2時可達最高值，約為0.88 U/mL（圖1B）.因此，3F1菌株作為一株低溫堿性淀粉酶生產菌株，其酶活的最適溫度為10 ℃和最適pH為10.2.

隨后對3F1菌株進行了形態學觀察.結果顯示，該菌株在28 ℃培養16 h后的菌落形態特征表現為：直徑大小約為1.48 mm，形態大致為圓形，顏色呈現乳白色，質地易挑起，表面無光澤，不透明，無隆起且邊緣不規則.挑取該菌落進行革蘭氏染色后在100倍光學顯微鏡下觀察，該菌株為長桿狀，革蘭氏染色為陽性.生理生化性質分析顯示： 3F1菌株過氧化氫酶、明膠液化和硝酸鹽還原性以及V-P試驗均呈陽性.通過16S rDNA序列比對和分析，初步鑒定3F1菌株屬于蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides），進而我們將其命名為Bacillus mycoides strain 3F1，簡稱Bm3F1.

3.2 菌株Bm3F1的發酵產酶條件優化

3.2.1 發酵時間對產酶的影響 為了確定Bm3F1在發酵培養過程中細菌生長情況與胞外淀粉酶酶活高低之間的關系，我們每隔6 h取樣測定細胞濃度和酶活，繪制了該菌株的發酵產酶曲線，以探究其產酶模型和發酵時間對酶活的影響，結果如圖2所示.在Bm3F1發酵產酶過程中，第三次取樣即18 h前，該菌株處于生長對數期，其胞外酶活也隨著細胞的快速生長而不斷上升，并在18 h時達到最高值，約為0.96 U/mL.因此，在18 h內Bm3F1的產酶模型為同步合成型.隨后，第四次取樣即24 h后，該菌株生長明顯減緩，進入生長平臺期，其胞外酶活呈現顯著下降趨勢.第五次取樣即30 h時其酶活低至0.42 U/mL.綜上，Bm3F1菌株的最佳發酵時間為18 h.

3.2.2 培養基作用底物類型和濃度對產酶的影響發酵培養基中成分的變化會影響菌株的產酶能力.通過在發酵培養基中添加不同淀粉酶作用底物類型，即可溶性淀粉（直鏈淀粉）、普魯蘭多糖（支鏈淀粉）、蔗糖和麥芽糖（雙糖），以探究底物類型對于菌株產酶的影響，結果如圖3所示.不同作用底物類型對Bm3F1產淀粉酶有不同程度的影響，其中在發酵培養基中添加可溶性淀粉時，所產酶活性最高，其次是普魯蘭多糖.據此可初步確定該菌株生產的淀粉酶屬于誘導型，即在發酵培養基環境中存在催化底物時，該酶可以高效合成并分泌到胞外，并且該淀粉酶種類屬于直鏈淀粉酶.又通過對可溶性淀粉濃度的梯度設置，以確定最優底物濃度，結果如圖4所示.當發酵培養基中可溶性淀粉的濃度為1.5%時，Bm3F1的酶活最高，約為3.07 U/mL.綜上，在發酵培養基中添加1.5%可溶性淀粉可顯著提高Bm3F1的產酶能力.

3.2.3 培養基初始pH和裝液量對產酶的影響 培養基初始pH值不僅會影響細菌生長還會改變酶類活性.通過設定培養基初始pH梯度以考察初始pH對生產菌株酶活的影響，結果見圖5.Bm3F1在培養基初始pH值為4.2～7.2時，其淀粉酶活性隨pH值的升高而顯著增強；當pH值為7.2～10.2時，其酶活雖呈現遞減趨勢，但相對穩定；當初始pH值為7.2時，其酶活達到最高值，約為3.52 U/mL.因此，選擇培養基初始pH 7.2.在確定最佳初始pH值后，我們需要進一步探究培養基裝液量對菌株產酶的影響，因為裝液量可反映菌株發酵過程中對溶氧量的需求，直接影響菌株生長情況.在250 mL三角瓶中裝入不同體積的培養基，以考察裝液量對產酶的影響，結果見圖6.裝液量為10 mL/250mL時，Bm3F1菌株的產酶能力最強，其酶活可達8.29 U/mL；而裝液量為25 mL/250 mL～150 mL/250 mL時，菌株的酶活逐漸減小，說明該菌株在發酵過程中需要較高的溶氧量.因此，我們選擇10 mL/250 mL為培養基最適裝液量.綜上，培養基初始pH 7.2和裝液量10 mL/250 mL可使Bm3F1菌株的酶活進一步提高.

3.2.4 發酵溫度和菌體接種量對產酶的影響 發酵溫度會顯著影響細菌生長狀況、代謝過程以及所產酶蛋白穩定性.通過設定發酵溫度梯度以考察發酵溫度對生產菌株酶活的影響，結果如圖7所示. Bm3F1在發酵溫度為20～30 ℃時， 其淀粉酶活性隨著溫度的升高而增強，當發酵溫度為30～45 ℃時，其酶活呈現顯著的遞減趨勢.當發酵溫度為30 ℃時，其酶活達到最高值，約為9.58 U/mL.因此，選擇發酵溫度30 ℃.在確定最佳發酵溫度后，我們需要進一步探究菌體接種量對菌株產酶的影響，因為接種量對于細菌細胞生長速率以及培養基營養成分消耗速率息息相關.通過設定接種量梯度以考察菌體接種量對產酶的影響，結果如圖8所示.當Bm3F1菌體接種量為1.0%～9.0%時，其淀粉酶活性隨著接種量的升高而增強，當接種量大于9.0%時，其酶活均下降.當接種量為9.0%時，其酶活達到最高值，約為13.58 U/mL.綜上，我們確定Bm3F1的最佳發酵溫度和最適菌體接種量分別為30 ℃和9.0%.

3.2.5 優化前后酶活對比 通過對上述發酵條件的逐一優化，最終確定了Bm3F1菌株的最佳發酵條件，即發酵時間為18 h、在發酵培養基中添加1.5%可溶性淀粉、培養基初始pH為7.2、裝液量為10 mL/250 mL、發酵溫度為30 ℃以及菌體接種量為9.0%.分別采用初始和最佳發酵條件對Bm3F1菌株進行發酵培養，并在10 ℃、pH 10.2條件下測定該菌株在優化前后的淀粉酶活性，其結果顯示，逐步優化后的最終酶活可達13.58 U/mL，是優化前0.93 U/mL的14.60倍.

4 討 論

本文從西藏林芝地區的土壤樣品中篩選獲得一株產低溫堿性淀粉酶蕈狀芽孢桿菌Bm3F1（Bacillus mycoides strain 3F1），其酶活最適條件為10℃、pH 10.2.有詳細的文獻記載蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）是一種耐寒性菌種，通?？梢栽? ℃或者更低溫度下生存［17， 18］.據此，我們推測Bm3F1菌株自身的適冷生存性賦予了其體內所產酶類的低溫活性.在寒冷惡劣的環境下，各種選擇壓力使得微生物不斷進化適應，促使其體內產生獨特的酶系統來適應生存環境.另外，芽孢桿菌屬（Bacillus）來源淀粉酶通常用于堿性pH條件［19］.例如2017年Simair等［20］分離獲得一株堿性淀粉酶生產菌株Bacillus sp. BCC 01-50，其酶活的最適pH為9.0.相比之下，本文獲得的Bm3F1菌株所產淀粉酶在堿適應性上更具備優勢（pH 10.2）.再如2018年Arabaci等［21］分離獲得一株產低溫堿性淀粉酶菌株Bacillus subtilis N8，其酶活最適條件為25 ℃、pH 8.0.相較而言，本文獲得的低溫堿性淀粉酶似乎具有更強的低溫活性（10 ℃）和堿適應性（pH 10.2）.

為了進一步挖掘Bm3F1生產菌株的工業應用價值和潛能，我們通過發酵條件優化來提高其產酶能力.研究結果發現該菌株所產淀粉酶的活性受到培養基作用底物類型和濃度、發酵時間和溫度、培養基初始pH和裝液量以及菌體接種量的影響.其中我們發現Bm3F1在發酵培養18 h后，其產酶活性開始呈現下降趨勢.這是由于隨著發酵培養時間的延長，菌株進入生長平臺期以后，一方面可能停止生產淀粉酶，另一方面可能所合成的其他蛋白酶將部分淀粉酶降解，或者已分泌的胞外淀粉酶被離子螯合而失活.我們還發現培養基初始pH和裝液量對Bm3F1菌株產淀粉酶能力具有明顯影響.這是由于初始pH值不僅可通過改變細菌細胞膜的通透性和穩定性來影響菌體對外界營養成分的吸收以及阻礙產物酶蛋白的分泌，而且可通過影響發酵培養基成分的離子化程度使發酵液中的酶類活性發生變化.培養基裝液量則通過影響發酵培養基的溶氧量直接影響菌株的生長速度.最后，我們發現Bm3F1菌株的發酵溫度低于30 ℃不利于菌體生長而影響其產酶過程，可導致胞外淀粉酶積累量較低.而較高溫度（35℃～45℃）則使菌株的產酶效果更差，嚴重影響其生長代謝過程；高溫條件還會影響發酵液中淀粉酶的穩定性，從而導致酶活性顯著降低.例如在45 ℃時酶活僅有0.98 U/mL.此外，我們發現Bm3F1菌體接種量為1.0%時酶活最低.這可能是由于接種量過小導致菌體生長速度較低，產酶活性也隨之下降；而過高的接種量如11%～15%使得發酵液中的菌體細胞濃度過高，培養基營養成分快速消耗，最終導致菌體細胞提前衰老死亡，影響了淀粉酶的胞外積累.

本研究結果表明，采用了優化后的最佳發酵條件對Bm3F1進行發酵培養，其淀粉酶活性最終可達13.58 U/mL，較優化前提高了13.60倍.該菌株經優化后的酶活距離工業應用標準仍然具有一定差距，我們期望在未來實驗中可通過對該菌株進行誘變選育來進一步提高其產酶量以提升其工業應用的潛能.

參考文獻：

［1］ Sun H， Zhao P， Ge X， et al. Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes ［J］. Appl Biochem Biotechnol， 2010， 160： 98.

［2］ Mehta D， Satyanarayana T. Bacterial andarchaeal α-amylases： diversity and amelioration of the desirable characteristics for industrial applications ［J］. Front Microbiol， 2016， 7： 1129.

［3］ Elyasi far B， Ahmadi Y， Yari khosroshahi A， et al. Microbial alpha-amylase production： progress， challenges and perspectives ［J］. Adv Pharm Bull， 2020，10： 350.

［4］ Farooq M A， Ali S， Hassan A， et al. Biosynthesis and industrial applications of α-amylase： a review ［J］. Arch? Microbiol， 2021， 203： 1281.

［5］ Erdal S E， Taskin M E. Production of α-amylase by Penicillium expansum MT-1 in solid-state fermentation using waste Loquat （Eriobotrya japonica Lindley） kernels as substrate ［J］. Rom Biotech Lett， 2010， 15： 5342.

［6］ Feller G， Lonhienne T， Deroanne C， et al. Purification， characterization， and nucleotide sequence of the thermolabile alpha-amylase from the antarctic psychrotroph Alteromonas haloplanctis A23 ［J］. J Bio Chem， 1992， 267： 5217.

［7］ Aghajari N， Feller G， Gerday C， et al. Crystal structures of the psychrophilic alpha-amylase from Alteromonas haloplanctis in its native form and complexed with an inhibitor ［J］. Protein Sci， 1998， 7： 564.

［8］ 徐玲， 唐茂妍， 陳旭東. 低溫淀粉酶的耐溫性研究 ［J］. 飼料工業， 2010， 31： 13.

［9］ 陳凱， 薛東紅， 夏尚遠， 等. 短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）XDH菌株發酵培養基配方的研究 ［J］. 山東農業大學學報： 自然科學版， 2006， 37： 190.

［10］ 唐嘉， 陳朝銀， 趙聲蘭， 等. 一種初篩產胞外淀粉酶菌株的簡化方法 ［J］. 生物加工過程， 2008， 6： 37.

［11］ 劉杰雄， 陳號， 陸雯， 等. 淀粉酶高產菌株的篩選及其酶活的測定［J］. 食品工程， 2010， 1： 45.

［12］ Yassin S N， Jiru T M， Indracanti M. Screening and characterization of thermostable amylase-producing bacteria isolated from soil samples of Adera， afar region， and molecular detection of amylase-coding gene ［J］. Int J Microbiol， 2021， 2021： 5592885.

［13］ Bernfeld P. Amylase， α and β ［J］. Method Enzymol， 1955， 1： 149.

［14］ 趙凱， 許鵬舉， 谷廣燁. 3，5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究［J］. 食品科學， 2008， 29： 534.

［15］ 蔡妙英， 東秀珠. 常見細菌系統鑒定手冊［M］. 北京： 科學出版社， 2001： 370.

［16］ Yoon S H， Ha S M， Kwon S， et al. Introducing EzBioCloud： a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole-genome assemblies ［J］. Int J Syst Evol Micr， 2017， 67： 1613.

［17］ Lechner S， Mayr R， Francis K P， et al. Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group ［J］. Int J Syst Bacteriol， 1998， 48： 1373.

［18］ Phan H， Sidorenko M L， Tsai P C， et al. Whole-genome shotgun sequence of Bacillus mycoides strain U53， a psychrotolerant bacterium isolated from the Sakhalin region in Russia ［J］. Microbiol Resour Announc， 2021， 10： e01257-20.

［19］ Kizhakedathil M P J， C S D. Acid stable α-amylase from Pseudomonas balearica VITPS19-production， purification and characterization ［J］. Biotechnol Rep （Amst）， 2021， 30： e00603.

［20］ Simair A A， Qureshi A S， Khushk I， et al. Production and partial characterization of α-amylase enzyme from Bacillus sp. BCC 01-50 and potential applications ［J］. Biomed Res Int， 2017， 2017： 9173040.

［21］ Arabaci N， Arikan B. Isolation and characterization of a cold-active， alkaline， detergent stable α-amylase from a novel bacterium Bacillus subtilis N8 ［J］. Prep Biochem Biotech， 2018， 48： 419.