不同氧濃度氣調(diào)和解封對(duì)片煙多酚氧化酶活性的影響及來(lái)源探究

摘要：為了研究氣調(diào)貯存和解封后使用過(guò)程中片煙多酚氧化酶（PPO）活性的變化及探究煙草中PPO的活性來(lái)源，以5種氧氣濃度氣調(diào)醇化的3種煙草片煙為研究對(duì)象，分別在氣調(diào)醇化的18個(gè)月、21個(gè)月和26個(gè)月時(shí)，取樣測(cè)定氣調(diào)貯存和解封1～3個(gè)月過(guò)程中片煙PPO的活性；并通過(guò)對(duì)片煙表面微生物的滅菌處理，研究片煙氣調(diào)過(guò)程中PPO的來(lái)源。結(jié)果表明，低氧氣調(diào)處理對(duì)PPO的活性有一定的抑制效果。解封后的2個(gè)月內(nèi)，4種低氧處理組片煙PPO的活性降幅均大于正常氧濃度處理組；且對(duì)于三種產(chǎn)地的片煙而言，采用2%～4%的氧氣濃度氣調(diào)處理都能較好地抑制PPO的活性。本研究證明了片煙的PPO活性來(lái)源于片煙內(nèi)部而非片煙表面微生物，2%～4%的低氧氣濃度氣調(diào)處理能有效降低PPO活性，有利于片煙中多酚類(lèi)物質(zhì)的保留，為片煙貯藏和解封后的生產(chǎn)和使用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：片煙；多酚氧化酶；氧濃度；氣調(diào)貯存

中圖分類(lèi)號(hào)：TS411 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0488-5368（2023）09-0008-05

收稿日期：2022-11-18修回日期：2023-02-03

基金項(xiàng)目：廣東中煙項(xiàng)目“廣東韶關(guān)倉(cāng)庫(kù)片煙醇化調(diào)控研究”（粵煙工[2021]科字第005號(hào)）。

第一作者簡(jiǎn)介：黃磊（1986-），男，湖南瀏陽(yáng)人，本科，農(nóng)藝師，從事煙葉倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)、煙葉評(píng)級(jí)工作。

通信作者：高群玉。Changes and Source Analysis of Polyphenol Oxidase Activity in Tobacco Under

Treatment of Different Oxygen Concentrations and" Unsealing

HUANG Lei GAO Jinjun WANG Xiaoyuan LIU Xin LI Yingzhi TANG Qian

LI Sai WANG Jianhe LU Huilin GAO Qunyu

（1.China Tobacco Guangdong Industrial Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong" 510145， China；2.School of Food Science

and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou，Guangdong" 510640， China）

Abstract：" In order to study the changes of polyphenol oxidase （PPO） activity in tobacco strips during controlled atmosphere storage and after unsealing. and to explore the source of PPO activity in tobacco， three kinds of tobacco strips alcoholized under five kinds of oxygen concentration were taken as the research objects， the PPO activity in tobacco strips during controlled atmosphere storage and after unsealing for 1～3 months was determined at 18 months， 21 months and 26 months， respectively. The source of PPO in the process of smoke adjustment was studied by sterilization of microorganisms on the surface of cigarette. The results showed that low oxygen treatment had a certain inhibitory effect on PPO activity. Within 2 months after unsealing， the PPO activity of the four low oxygen treatment groups decreased more compared with the normal oxygen concentration treatment group. For the three kinds of origin of tobacco， 2%～4% oxygen concentration of modified atmosphere treatment could better inhibit the activity of PPO. This study proved that the PPO activity of the tobacco sheet was derived from the microorganisms inside the tobacco sheet rather than the microorganisms on the surface of the tobacco sheet. The low oxygen concentration of 2%～4% could effectively reduce the PPO activity， which was beneficial to the retention of polyphenols in the tobacco sheet. This study provides a theoretical basis for the production and use of tobacco sheet after storage and unsealing.

Key words： Tobacco; Polyphenol oxidase; Oxygen concentration; Controlled atmosphere storage

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，以下簡(jiǎn)稱(chēng)PPO）普遍存在于自然界中的植物、真菌等當(dāng)中[1～4]。煙草當(dāng)中也存在著PPO，在煙葉烘烤過(guò)程中，片煙中多酚、色素等物質(zhì)的含量會(huì)隨PPO的氧化作用而發(fā)生變化，其原理是：PPO催化各種酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，再經(jīng)聚合成黑色素，最終導(dǎo)致片煙的顏色變深[5]。同時(shí)，多酚類(lèi)物質(zhì)的減少也會(huì)對(duì)煙葉的調(diào)制特性、香氣吃味、香味強(qiáng)度等方面產(chǎn)生影響，造成片煙的品質(zhì)下降[6～8]。這就是過(guò)度醇化后片煙品質(zhì)變差的一個(gè)重要原因[9～12]。氣調(diào)處理可以對(duì)片煙的醇化過(guò)程進(jìn)行控制[13]，主要是通過(guò)抑制PPO的活性實(shí)現(xiàn)的，而不同氣調(diào)氧化方式對(duì)煙草的品質(zhì)也有影響[13～15]。

目前關(guān)于抑制煙草中PPO的活性方面已有大量研究，武德傳等人[16]綜述了溫度、pH、煙草PPO的激活效應(yīng)等方面對(duì)煙草PPO活性的影響；蘭俊榮等人[2]研究了烘烤過(guò)不同部位不同成熟度的煙葉PPO的活性變化差異；李明[17]研究了抑制劑對(duì)PPO活性及煙葉烘烤效果的影響，結(jié)果表明抑制劑能對(duì)PPO活性起到較好的抑制作用[18]，但抑制劑的添加可能會(huì)對(duì)煙葉的口感造成一定影響；有研究表明PPO的活性也受到外界氧氣的影響[19， 20]。田玉庭[21]從澳洲青蘋(píng)中分離純化出PPO，證明4%的氧氣濃度可完全抑制青蘋(píng)的PPO的活性，N2、CO2都能通過(guò)降低反應(yīng)體系中氧氣濃度而達(dá)到抑制PPO活性的目的。恩仁[22]通過(guò)密封降氧處理發(fā)現(xiàn)PPO的活性變化較小，一般稍高于正常貯存，但其對(duì)不同降氧氣調(diào)醇化的影響并未研究。此外，現(xiàn)階段有關(guān)煙葉PPO的研究主要是在鮮煙葉或者初烤煙葉環(huán)節(jié)，對(duì)經(jīng)初烤和復(fù)烤后片煙殘存的PPO活性和片煙倉(cāng)貯環(huán)節(jié)不同氧濃度氣調(diào)處理?xiàng)l件下PPO活性變化的研究尚不完善。

因此，本研究主要通過(guò)分析對(duì)比不同產(chǎn)地的片煙，研究不同低氧氣濃度下密封貯存的復(fù)烤片煙PPO活性差異以及解封后一段時(shí)間內(nèi)PPO活性變化，探明煙草表面微生物是否影響煙草PPO活性，最終了解PPO主要來(lái)源及其在低氧環(huán)境下的活性變化，為片煙貯存和解封后投入生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料

2019/云南普洱/中桔三（C1）/混打片煙，2019/湖南/中桔三（C1）/混打片煙，2019/貴州遵義/中桔三C3F/單打片煙。1.2存放設(shè)置及取樣方法

從2019/云南普洱/中桔三（C1）/混打片煙，2019/湖南/中桔三（C1）/混打片煙，2019/貴州遵義/中桔三C3F/單打片煙每個(gè)加工后等級(jí)選擇5箱成品，每個(gè)物料成品要求為同一班次同一儲(chǔ)料柜加工煙葉，5箱煙葉的箱號(hào)相連，視為5箱連號(hào)的試驗(yàn)片煙原料質(zhì)量一致。5箱片煙按照醇化處理?xiàng)l件分別是氧濃度2%以下、4%±2%、8%±2%、12%±2%、21%五種進(jìn)行氣調(diào)養(yǎng)護(hù)。

為減少因取樣給片煙儲(chǔ)存環(huán)節(jié)帶來(lái)的擾動(dòng)，樣品歸集封堆前，在取樣箱號(hào)表面預(yù)先切好尺寸為15 cm*11 cm*5 cm的塊樣（重約0.3 kg，A5紙大小），后續(xù)直接從密封堆垛取樣。

所有煙葉樣品于2020年4月開(kāi)始按不同氧濃度氣調(diào)醇化，醇化18個(gè)月后于2021年10月開(kāi)始取樣，醇化21個(gè)月后于2022年1月第二次取樣，醇化26個(gè)月后于2022年6月第三次取樣，每個(gè)等級(jí)在完成取樣后，從氧濃度2%以下，4%±2%、8%±2%、12%±2%、21%氣調(diào)養(yǎng)護(hù)的密封堆垛中，再各取3塊塊樣，拿出后放在同堆垛普通室外環(huán)境中正常空氣條件存放，分別在放置1個(gè)月后、2個(gè)月后、3個(gè)月后取樣，即分別于2022年7月，8月、9月取樣。1.3煙草樣品處理與測(cè)定方法

1.3.1樣品處理

（1）不同醇化時(shí)間處理

分別在5個(gè)氣調(diào)氧濃度下醇化，在醇化的18個(gè)月、21個(gè)月和26個(gè)月取樣，分別測(cè)定5個(gè)氧濃度拿出的片煙PPO活性。

（2） 解封后不同醇化時(shí)間處理

在5個(gè)氧濃度處理的26個(gè)月后，模擬片煙需要生產(chǎn)使用，從密封堆垛中解封，測(cè)定解封1、2、3個(gè)月時(shí)5個(gè)氧濃度處理后的片煙PPO活性。

（3）片煙酶活性來(lái)源處理

為了探究表面微生物對(duì)煙草PPO活性的影響，通過(guò)紫外燈照射、酒精噴涂?jī)煞N方式處理煙葉表面，測(cè)定處理后的云南普洱和貴州遵義兩種片煙的PPO活性與原片煙的差異。

1.3.2PPO活性的測(cè)定方法[2]PPO 提取：稱(chēng)取葉片 1.0 g，加入 0.05 moL/L pH 值6.8的磷酸緩沖液8mL 和 1.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP），1.5 g 石英砂，冰浴中研磨勻漿；在10 000 r/min、4℃條件下離心20 min，取上清液。

PPO 活性測(cè)定：在試管中依次加入 0.2 moL/L 鄰苯二酚 1.5 mL、0.05 moL/L pH 值6.8 的磷酸緩沖液 1.5 mL、酶液 50 μL，以蒸餾水代替酶液做空白對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)398 nm波長(zhǎng)的OD值，分別讀取0 min、1 min、2 min后的讀數(shù)。酶活性以每分鐘每克干重?zé)熑~OD值的變化表示（ΔOD/（g 干重·min）），三次平行取平均值。

不同醇化時(shí)間PPO消耗率的計(jì)算：

SC_t（%）=U₀-U_t/U₀×100%

SCt為醇化t個(gè)月PPO的消耗率；U0為醇化18個(gè)月煙葉中PPO的活性值；Ut為醇化t個(gè)月煙葉中PPO的活性值。

不同解封時(shí)間PPO消耗率的計(jì)算：

SC_n（%）=U₁-U_n/U₁×100%

SC_n為解封n個(gè)月PPO的消耗率；U₁為醇化26個(gè)月煙葉中PPO的活性值；U_n為解封n個(gè)月煙葉中PPO的活性值。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2020、IBM SPSS Statistics26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；使用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。2結(jié)果與分析2.1不同氧濃度氣調(diào)醇化時(shí)間對(duì)酶活的影響

如圖1所示，圖中各點(diǎn)代表三種煙草在不同氧濃度下（2%以下、4%±2%、8%±2%、12%±2%、21%±2%）分別醇化18個(gè)月、21個(gè)月、26個(gè)月后的PPO活性值；柱狀圖則記錄了以18個(gè)月的酶活值作為初始參照點(diǎn)，繼續(xù)醇化3個(gè)月（醇化21個(gè)月）和8個(gè)月（醇化26個(gè)月）后的PPO活性變化消耗率。由圖可知，隨著醇化時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草中PPO的活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且前三個(gè)月的降幅明顯大于后三個(gè)月降幅。對(duì)于不同種煙葉，氧濃度的變化對(duì)酶活的影響略有差異，但總體而言，降低氧氣濃度有利于抑制煙草中PPO的活性，且在低氧濃度下（2%以下和4%±2%）有較為顯著的抑制效果；中等氧濃度（8%±2%和12%±2%）下的抑制效果則和常氧相近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明煙葉中PPO活性與其儲(chǔ)存環(huán)境中的氧氣含量呈正相關(guān)，低氧氣調(diào)處理可以有效抑制煙葉PPO的活性。

2.2不同氧濃度氣調(diào)解封后不同時(shí)間對(duì)酶活的影響如圖2所示，圖2中各點(diǎn)代表三種煙草在不同氧濃度下（2%以下、4%±2%、8%±2%、12%±2%、21%±2%）醇化26個(gè)月以及經(jīng)26個(gè)月醇化后解封1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月的PPO活性值；柱狀圖則記錄了解封后1～3個(gè)月的PPO活性變化消耗率。由圖2可知，煙草中的PPO活性隨解封時(shí)間的增加而下降，且解封2～3個(gè)月內(nèi)的變化量大于解封1～2個(gè)月內(nèi)的變化量。綜合三種煙草解封后的酶活變化可知，與常氧處理組相比，降氧氣調(diào)處理能在一定程度上提高煙草解封后PPO活性的消耗率，使酶活保持相對(duì)較低的水平；低氧氣濃度氣調(diào)（2%以下和4%±2%）對(duì)酶活消耗的促進(jìn)作用比中等氧氣濃度氣調(diào)（8%±2%和12%±2%）的作用效果更為顯著。

解封3個(gè)月后，三種煙草在各氧氣濃度下的酶活消耗率均達(dá)90%左右，此時(shí)煙草中PPO的活性幾乎為0，各氧氣濃度處理組無(wú)明顯差異。這可能是因?yàn)樵撾A段已經(jīng)處于煙草醇化的末期[23]，加上與外界氧氣的充分接觸，加速了酶活的消耗。

2.3煙葉表面微生物對(duì)酶活的影響

表1記錄了醇化26個(gè)月后的兩種不同煙草分別經(jīng)紫外照射、酒精噴涂處理后的PPO活性。通過(guò)紫外燈照射20 min和酒精噴涂風(fēng)干兩種處理方式足以消除煙草表面的微生物。但由顯著性分析可知，上述兩種處理方式并沒(méi)有造成煙草中PPO活性的明顯變化，即處理組的酶活與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了煙草中的PPO來(lái)源于煙草細(xì)胞內(nèi)部而非其表面微生物的結(jié)論[24]。

3小結(jié)與討論

為研究不同氧濃度氣調(diào)貯存和解封后片煙PPO活性變化及活性來(lái)源，本研究以5種氧氣濃度密封醇化3種煙草片煙，以正常氧氣濃度（21%±2%）作為對(duì)照組。通過(guò)對(duì)比研究，在醇化18個(gè)月時(shí)間內(nèi)，2%～4%的氧氣濃度，能夠有效抑制PPO的活性；醇化26個(gè)月后，解封不同氧濃度氣調(diào)處理的片煙，在解封后的3個(gè)月內(nèi)，低氧氣調(diào)處理片煙中的PPO活性比正常氧氣濃度明顯更低；此外，本研究排除了PPO活性來(lái)源于表面微生物的可能。

片煙在醇化18個(gè)月后，在2%～4%的低氧濃度下，抑制PPO活性較好；在8%～12%的中等氧濃度下，PPO的抑制效果則稍顯遜色。說(shuō)明降低氧濃度能夠減少多酚類(lèi)物質(zhì)被分解，有利于片煙的貯藏保存，在此后繼續(xù)醇化8個(gè)月下，降低氧氣濃度抑制或提高PPO活性的作用都達(dá)到極限，不同氧氣濃度下繼續(xù)貯藏PPO的活性變化差異不大。

片煙經(jīng)過(guò)26個(gè)月的低氧醇化，在解封后的2個(gè)月內(nèi)PPO的活性有明顯下降，可能是由于片煙前期已經(jīng)適應(yīng)了低氧的環(huán)境，解封后氧濃度的突然增大造成的。總體而言。在解封后自然醇化的3個(gè)月內(nèi)，低氧氣調(diào)處理的片煙PPO活性降低得更明顯。在片煙生產(chǎn)使用過(guò)程中，片煙從密封堆垛中取出后常常會(huì)儲(chǔ)藏一定的時(shí)間才能投入生產(chǎn)，根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，煙草從業(yè)人員可結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)狀況在片煙醇化過(guò)程中適當(dāng)降低氧濃度，使PPO的活性隨之降低，這一措施有利于減少醇化過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)的分解，以便于最大限度地保證片煙的質(zhì)量。

通過(guò)表面滅菌處理，排除了不同氧濃度氣調(diào)解封后微生物等的繁殖帶來(lái)的PPO活性變化，證明了煙草表面微生物對(duì)煙草片煙的PPO活性沒(méi)有影響，PPO活性來(lái)源于煙草內(nèi)部，表面微生物對(duì)PPO活性并未起到抑制或者強(qiáng)化的作用。

本實(shí)驗(yàn)探究出在2%～4%氧氣濃度下PPO的活性和解封后一段時(shí)間內(nèi)的PPO活性都相比正常氧濃度的低，有利于煙草的貯藏和解封后一段時(shí)間投入使用，為片煙貯藏和生產(chǎn)使用提供一定的理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：

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