新疆桑葚總黃酮含量與其抗氧化活性的研究

摘要：本研究采用響應面分析法對桑葚總黃酮的提取工藝進行優化，測定新疆不同產地、不同品種桑葚中總黃酮含量及其抗氧化活性，并分析桑葚總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性。以期為新疆桑葚的資源開發、食品加工等提供一定的參考。試驗在單因素的基礎上，以體積分數、料液比以及超聲時間為影響因素， 桑葚總黃酮提取量作為指標，采用響應面分析法對桑葚總黃酮的提取工藝進行了優化。結果表明，乙醇體積分數84%，超聲時間81 min，料液比 1∶11 （g/mL），在該條件下桑葚總黃酮的提取量為（1.78±0.10） mg/g，與模型預測值差距小，提取工藝準確可行。新疆桑葚總黃酮的含量在不同產地、不同品種之間的差異具有統計學意義（Plt;0.01）。白桑的總黃酮含量比黑桑和藥桑低（Plt;0.01）;黑桑的總黃酮含量在吐魯番地區與喀什地區較高；藥桑的總黃酮含量在阿克蘇地區與和田地區較高。抗氧化實驗證明桑葚具有良好的抗氧化活性，不同產地、不同品種桑葚的抗氧化活性之間的差異具有統計學意義（Plt;0.05）。白桑的抗氧化活性比黑桑和藥桑弱;黑桑在吐魯番地區的抗氧化活性最強（Plt;0.05）；藥桑在阿克蘇地區的抗氧化活性最強（Plt;0.01）。 桑葚中總黃酮含量與抗氧化活性呈正相關（Plt;0.01）。

關鍵詞：桑葚；總黃酮；抗氧化活性；響應面法

中圖分類號：S663文獻標識碼：A文章編號：0488-5368（2023）09-0013-09

收稿日期：2023-04-12修回日期：2023-05-20

基金項目：自治區創新環境（人才、基地）建設專項一科技創新基地建設計劃（資源共享平臺建設）（PT2018）；全民營養科研基金（CNS-NNSRG2019-96）；2022年新疆醫科大學研究生實踐創新項目（CXCY2022045）。

第一作者簡介：賀詩茹（1996-），女，湖南株州人，碩士，主要從事植物活性物質研究。

通信作者：肖輝。Total Flavonoid Content and Antioxidant Activity

of Mulberries from Xinjiang

HE Shiru，WANG" Qian，AYINUER·Baikere，LIU Mengwen4，SHEN Jing，LI Wenyu，XIAO Hui

（School of Public Health， Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830000， China）

Abstract：In this study， response surface analysis was used to optimize the extraction process of total flavonoids from mulberries， determine the content of total flavonoids and its antioxidant activity in different habitats and varieties of mulberries in Xinjiang， and also analyze the correlation between total flavonoids content and antioxidant activity in mulberries， the aim is to provide a reference for resource development and food processing of mulberries in Xinjiang. On the basis of single factors， with volume fraction， solid-liquid ratio and ultrasonic time as influencing factors and total flavonoids extraction amount of mulberries as index， response surface analysis was used to optimize the extraction process of total flavonoids of mulberries. The results showed that the optimal process conditions were as follows： ethanol volume fraction of 84%， ultrasonic time of 81 min， solid-liquid ratio of 1∶11 （g/mL）. Under above conditions， the extraction amount of total flavonoids from mulberry was （1.78±0.10） mg/g，" little difference with the predicted value of the model， and the extraction process was accurate and feasible; The content of total flavonoids in Xinjiang mulberries was significantly different in different habitats and varieties （Plt;0.01）. The total flavonoids content of white mulberry was lower than that of black mulberry and medicinal mulberry （Plt;0.01）. The flavonoid content of black mulberry was higher in Turpan and Kashgar areas. The content of total flavonoids was higher in Aksu area and Hotan area; Antioxidant experiments showed that mulberries had good antioxidant activities， and the differences of antioxidant activities of mulberries from different habitats and varieties were statistically significant （Plt;0.05）. The antioxidant activity of white mulberry was weaker than that of black mulberry and medicinal mulberry. The antioxidant activity of black mulberry was the strongest in Turpan （Plt;0.05）; The antioxidant activity of Chinese mulberry was the strongest in Aksu region （Plt;0.01）.; Total flavonoid content in mulberry was positively correlated with antioxidant activity （Plt;0.01）.

Key words： Mulberries; Total flavonoids; Antioxidant activity; Response surface method

桑葚（Fructus Mori）為桑科桑屬桑樹的果實，是由多數小瘦果集合而成的聚花果， 多為圓形或柱形，果實有暗紅色、紫黑色和白色等幾種。我國早在5 000年前就已經開始種植桑樹，也是世界上桑樹品種最多的國家，如今26個省市和自治區都有分布。新疆地區擁有光照豐富、氣候干旱、晝夜溫差大的特殊自然環境，有利于植物的光合作用，且病蟲災害少，能更好的轉化和積累營養成分。根據《新疆植物志》記載新疆地產的桑葚品種主要有2種及1變種即白桑、黑桑和藥桑三大類，其中，白桑在植物學分類上屬于桑屬白桑種，黑桑為白桑種的變種韃靼桑，藥桑在植物學分類上屬于桑屬黑桑種[1]。藥桑起源于伊朗，于公元16世紀引入我國新疆地區，是極為稀有的體細胞染色體倍數為22倍體的桑種，同時也是我國唯一的黑桑種，主要栽培于新疆南部極具地域特性[2]。

桑葚中不僅營養成分豐富[3～5]，還富含多種植物化學物成分，主要為黃酮類、酚酸類、花色苷類等[6～8]。其中，黃酮類化合物對植物的生長、發育、開花、結果、抵御異物的侵襲有重要作用[9， 10]，且具有抗氧化、降糖降脂、保護神經、抗炎抗菌、抗癌抗腫瘤等功效[11～16]。由于地理、氣候條件以及品種方面的區別，桑葚中植物化學物的含量難免有所差異[17]。因此，合理的根據桑葚中物質成分及特點進行開發加工，是拓展新疆桑葚資源利用途徑、提高經濟效益的關鍵。目前，國內外學者對桑葚的研究多集中于內地品種且產地單一，對新疆不同產地、不同品種桑葚的研究尚有不少空白。因此，本研究采用響應面分析法對桑葚總黃酮的提取工藝進行優化，測定新疆不同產地、不同品種桑葚中總黃酮的含量，采用總抗氧化能力（ABTS法）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率對桑葚進行抗氧化活性的測定，并分析桑葚總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性，以期為新疆桑葚相關領域的深入研究和地方經濟發展提供一定的數據支撐。1材料與方法1.1材料與試劑

在生產季節分別于白桑、黑桑和藥桑的產地，每個品種隨機選擇三至四個地區采摘，每個地區選擇三個市/區縣，每個市/區縣選擇≥3個生產基地作為采樣點進行人工采摘，再將三個采樣點的樣品均勻混合，作為一個市/區縣的樣品見表1。將樣品低溫保存帶回實驗室，挑選大小、重量、顏色和成熟度基本一致、果形相對均勻的無損傷新鮮果實。先用清水、蒸餾水清洗干凈，去掉污漬、泥沙，用紗布輕輕拭干表面水分，去除根蒂等不可食部，勻漿后-80 ℃冷凍貯藏備用。

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等（均為分析純）、蘆丁標準品：國藥集團化學試劑有限公司；總抗氧化能力（ABTS+）、DPPH自由基清除率和超氧陰離子（·O2-）清除能力測定試劑盒 均購置蘇州格銳思生物科技有限公司。1.2儀器與設備

UV-2600紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；KQ－600 KED 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；3-30K離心機（德國sigma公司）；RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器）；MS205DU型1/100000電子分析天平（梅特勒托利多集團）；全波長酶標儀Multiskan GO（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1桑葚總黃酮測定方法

（1）標準溶液配制

精密稱取蘆丁標準品10.00 mg，在避光條件下以80%的乙醇溶解，搖勻定容至10 mL，得濃度為1 mg/mL蘆丁標準品溶液。

（2）標準曲線的制作

精密吸取蘆丁標準品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別加于10 mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4 %氫氧化鈉溶液4 mL，混合搖勻，靜置15 min后，用純水定容，混合搖勻，靜置30 min后，在最大吸收波長處測得吸光度值。以標準品溶液濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程：Y=0.012 6X-0.029 5，R2=0.999 0。

（3）總黃酮提取量測定

精密稱取桑葚樣品5.00 g，置于150 mL錐形瓶中，加入一定體積的乙醇溶液搖勻，在超聲功率480 W下以一定的溫度、時間提取后，在轉速7 000 r/min、溫度為4 ℃下離心10 min，濾渣以同樣的步驟再提取一次，合并兩次提取的上清液后過濾旋轉蒸發，再用一定體積的乙醇溶液定容至10 mL，即得桑葚總黃酮提取液。

總黃酮提取量（mg/g）= C×D×V/M×B×1 000

式中C為標曲計算出的樣品質量濃度（mg/mL）；D為測定時定容的體積（mL）；V為提取液定容體積（mL）；B為吸取測定體積（mL）；M為稱取的樣品質量（g）。

1.3.2單因素實驗精密吐魯番市白桑樣品5.00 g，在設定的實驗條件下超聲提取，每個樣品平行制備3份，按照標準曲線的制作測定吸光度，每份樣品平行測定3次，依據標準曲線方程計算桑葚樣品總黃酮提取量。

（1）超聲溫度對桑葚總黃酮提取量的影響

在乙醇體積分數為80 %，料液比1∶10（g/mL）、超聲時間60 min，提取2次的條件下，考察超聲30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃對桑葚總黃酮提取量的影響。

（2）乙醇體積分數對桑葚總黃酮提取量的影響

在料液比1：10（g/mL），超聲溫度60 ℃，超聲時間60 min，提取2次的條件下，考察體積分數40%、50%、60%、70%、80%、90%對桑葚總黃酮提取量的影響。

（3）超聲時間對桑葚總黃酮提取量的影響

在乙醇體積分數為80 %，料液比1∶10（g/mL），超聲溫度60 ℃，提取2次的條件下，考察超聲時間30 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min對桑葚總黃酮提取量的影響。

（4）料液比對桑葚總黃酮提取量的影響

在乙醇體積分數為80 %，超聲溫度60 ℃，超聲時間60 min，提取2次的條件下，考察料液比1∶5 （g/mL）、1∶10 （g/mL）、1∶15 （g/mL）、1∶20 （g/mL）、1∶30 （g/mL）對桑葚總黃酮提取量的影響。

1.3.3響應面優化試驗設計根據Box-Behnken中心組合試驗設計，在單因素試驗基礎上，以體積分數（A）、超聲時間（B）、料液比（C）為自變量，桑葚總黃酮提取量（Y）為響應值進行設計試驗，采用3因素3水平響應面法，建立回歸模型，對桑葚總黃酮提取條件進行優化。見表2。

1.3.4抗氧化活性測定

（1）桑葚提取液對ABTS自由基清除能力

于96孔板的測定孔中加10 μL稀釋后的桑葚樣本提取液溶液，再加190 μL 的ABTS溶液，在相應的對照孔中加10 μL稀釋后的桑葚樣本提取液溶液，再加190 μL 的80 %乙醇溶液，在空白孔中加10 μL的80 %乙醇溶液，再加190 μL 的ABTS溶液。全部混勻后，在室溫25 ℃下，避光靜置6 min，然后在414 nm處測定吸光值，每個樣本平行測定3次。以水溶性維生素E（Trolox）摩爾濃度為X，以ΔA：空白孔吸光值-（測定孔吸光值-對照孔吸光值）為Y，繪制標準曲線，建立回歸方程，得y=1.7571x-0.0218，R²為0.9991。再依下式計算不同產地、不同品種桑葚提取液的ABTS自由基清除能力，結果以μmol TE/mL表示。

ABTS自由基清除能力（μmol TE/mL）= （ΔA+0.0218）/（1.7571×V）÷V×D

式中：V為提取液定容體積（mL）；D為稀釋倍數。

（2）桑葚提取液對DPPH自由基清除率

在EP管中加入150 μL稀釋后的桑葚樣本提取液溶液，再加入150 μL的DPPH溶液，即為測定管；在EP管中加入150 μL稀釋后的桑葚樣本提取液溶液，再加入150 μL的 80 %乙醇溶液，即為相應的對照管；在EP管中加入150 μL的80 %乙醇溶液，再加入150 μL的 DPPH溶液，即為空白管。全部混勻后，在室溫25 ℃下，避光靜置30 min，每個樣品平行制備3份。從各個EP管取200 μL加入96孔板中，然后在517 nm處測定吸光值，每個樣本平行測定3次。依下式計算不同產地、不同品種桑葚提取液的DPPH自由基清除能力，結果以%表示。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（測定孔吸光值-對照孔吸光值）/空白孔吸光值]×100

（3）桑葚提取液對超氧陰離子清除率

在96孔板中加入10 μL稀釋后的桑葚樣本提取液溶液，再加入190 μL配置好的工作液，即為測定孔。在96孔板中加入10 μL稀釋后的桑葚樣本提取液溶液，再加入除顯色劑外的工作液190 μL，即為相應的對照孔。在96孔板中加入除樣本溶液之外的工作液200 μL，即為空白孔。混勻后，在37 ℃下，反應10 min。每個樣品平行制備3份。然后在570 nm處測定吸光值，依下式計算不同產地、不同品種桑葚提取液的超氧陰離子清除率，結果以%表示。

超氧陰離子清除率（%）=[1-（測定孔吸光值-對照孔吸光值）/空白孔吸光值]×100

1.4數據處理

響應面分析法采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析及模型建立。實驗數據采用 Excel錄入，運用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量資料表示為（x±s ），組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）進行，采用 LSD 法進行多重比較，檢驗水準α=0.05。采用Pearson相關進行相關性分析，當相關系數絕對值大于0.7時，認為兩個變量之間密切相關。2結果與分析2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1提取溫度對桑葚總黃酮提取量的影響由圖1可知，隨著溫度的升高，桑葚總黃酮提取量先升高后降低。當溫度為 60 ℃時，提取量達到最大（Plt;0.01），當超聲溫度大于60 ℃時，提取量開始下降。推測可能是超聲溫度越高，影響部分黃酮化合物結構的穩定性。因此，在其他條件確定時，超聲最適溫度應控制在60 ℃左右。

2.1.2乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響如圖2所示，隨著乙醇體積分數的增大，總黃酮的提取量也增加，當體積分數為80 %時提取量達到最高，而后隨著體積分數的增加，提取量逐漸降低。可能是當體積分數為超過80 %時，提取液中除黃酮外的其他物質的提取率也隨之提高，從而影響黃酮類物質的提取[18]。因此，在其他條件確定時，提取桑葚總黃酮最適乙醇體積分數為80 %。

2.1.3超聲時間對桑葚總黃酮提取量的影響由圖3可知，超聲時間在90 min之前，桑葚總黃酮提取量隨著超聲時間的增長而升高，這可能是因為指標成分與溶劑邊界層存在濃度差，超聲時間延長強化了空化和機械效應，而有利于有效成分的溶出[19]。當超聲時間90 min之后，提取量隨著時間的增加而降低。推測可能是超聲時間越長，影響部分黃酮化合物的穩定性，同時雜質的溶出也會增加[20]。因此，在其他條件確定時，提取桑葚總黃酮最適超聲時間為90 min。

2.1.4料液比對桑葚總黃酮提取量的影響由圖4可知，料液比在1∶5（g/mL）～ 1∶15（g/mL）之間桑葚總黃酮提取量較高，當料液比大于1∶15（g/mL）后總黃酮提取量隨之下降，推測其原因可能是溶劑過多，使桑葚受到超聲波的空化效應減弱[21]。因此，在其他條件確定時，提取桑葚總黃酮最適料液比為1∶5（g/mL）～ 1∶15（g/mL）之間。

2.2響應面實驗結果與分析

2.2.1響應面實驗設計及結果對表3的17個實驗數據進行分析，隨著因子水平的組合變化，桑葚總黃酮提取在1.125 mg/g ～ 1.758 mg/g范圍內波動。采用Design Expert軟件對實驗結果進行擬合分析，得到二次多項式回歸模型為：Y=1.745 8-0.069 875A-0.028 625B+0.071C-0.031AB-0.03 525AC+0.04 975BC-0.433 4A2-0.051 9B2-0.106 65C2。

2.2.2回歸模型的建立及方差分析回歸模型進一步應用方差分析及顯著性檢驗進行評估，結果見表4。從表中可以看出，回歸方程模型方差分析結果F值為505.155 4，Plt;0.001 ，失擬項F值為0.6711，Pgt;0.05，說明了模型失擬和純誤差造成的提取量變異之間的差異不具有統計學意義。相關系數R²=0.998 5，調整系數 R2Adj=0.996 5，表示能夠解釋99.85%的變化，說明該模型的擬合度好。變異系數CV為1.01%，說明結果準確性和可靠性較高。Adeq Precision值為56.914，表明模型抗干擾能力良好，在自變量范圍內是準確可靠的。

由方差分析表中的F值和P值可知， A、B、C、AB、BC、AC因素對響應值的影響具有統計學意義（Plt;0.01）。從響應面回歸方程F值可以得出，桑葚總黃酮提取量影響程度的排序依次為：料液比（C）gt;乙醇體積分數（A）gt;超聲時間（B）。

2.2.3響應面交互作用分析圖5是桑葚總黃酮提取量響應值與相對應的影響因素構成的響應面圖與等高線圖，由圖5可知，隨著乙醇體積分數、超聲時間、料液比的增大，桑葚總黃酮提取量均是先上升后下降的變化趨勢。響應曲面越陡峭，表明條件的改變對響應值的影響越大[19]，且等高線形狀越趨向于橢圓形交互作用越顯著[22]。AB、AC、BC兩兩之間的曲面都較為陡峭，等高線圖也都是橢圓形狀，且AB、AC、BC之間對響應值的影響具有統計學意義（Plt;0.01），說明乙醇體積分數、超聲時間、料液比兩兩之間的交互作用具有統計學意義（Plt;0.01）。

2.2.4驗證試驗通過回歸方程及響應面圖得到最優工藝條件為乙醇體積分數83.92 %，超聲時間81.07 min， 料液比1∶10.99 （g/mL），總黃酮理論提取量為1.663 mg/g。考慮具體實驗和精確性，將提取條件調整為乙醇體積分數84 %，超聲時間81 min，料液比 1∶11（g/mL），在此條件下平行提取三次得到實際的桑葚總黃酮提取量為（1.78±0.10）mg/g，該值與預測值相差較小，表明該模型基本準確，該工藝用作桑葚總黃酮的提取具有一定的可行性。2.3新疆桑葚總黃酮含量的測定

由表5顯示，不同品種桑葚總黃酮含量差異較大，這與文獻結果相一致[4， 23]。且不同品種桑葚總黃酮含量之間的差異具有統計學意義（Plt;0.001），兩兩比較后，表明白桑的總黃酮含量比黑桑和藥桑低，這與汪荷澄[6]和劉晴晴[24]的研究結果相似。這可能是由于黑桑與藥桑中花色苷類含量比白桑豐富有關[6]。黑桑總黃酮含量為（3.81±0.89） mg/g，比李慧[25]檢測出河北的黑桑品種總黃酮1.20 mg/g高，這可能由于新疆高緯度、日照充足、晝夜溫差大的特點，有利于植物中黃酮類、酚酸類等次生代謝產物的運輸、轉化和積累。

由表6顯示，從產地來看，白桑、黑桑、藥桑總黃酮含量之間的差異具有統計學意義（Plt;0.001），且白桑的總黃酮含量在吐魯番地區與阿克蘇地區比喀什地區與和田地區高。黑桑的總黃酮含量在吐魯番地區與喀什地區比阿克蘇地區與和田地區高。和田地區藥桑總黃酮含量最高。這些差異可能是由于產地及種植過程土壤水分、酸堿度等因素導致的[26～28]。

2.4新疆桑葚抗氧化活性的測定

2.4.1桑葚提取液ABTS自由基清除能力的測定" " 按照ABTS自由基清除能力測定方法，對新疆桑葚樣品ABTS自由基清除能力進行測定，結果見表7、表8。總體來看，不同產地、不同品種桑葚ABTS總抗氧化能力之間的差異具有統計學意義（Plt;0.05）。從品種方面看，白桑的ABTS自由基清除能力比黑桑和藥桑弱。從地區方面看，黑桑在吐魯番地區的ABTS自由基清除能力最強。藥桑在阿克蘇地區的ABTS自由基清除能力最強。

2.4.2桑葚提取液DPPH自由基清除率的測定按照桑葚DPPH自由基清除率測定方法，對新疆桑葚DPPH自由基清除率進行測定。結果見表7、表8。總體來看，DPPH自由基清除率在產地和品種之間的差異具有統計學意義（Plt;0.01）。從品種方面來看，黑桑的DPPH自由基清除率最高，其次是藥桑，白桑最低。從地區方面看，白桑在阿克蘇地區的DPPH自由基清除率最高。黑桑在吐魯番地區的DPPH自由基清除率最高，其次是喀什地區。藥桑在和田地區的DPPH自由基清除率最高。

2.4.3桑葚提取液超氧陰離子清除率的測定按照桑葚超氧陰離子清除率測定方法，對新疆桑葚的超氧陰離子清除率進行測定，結果見表7、表8。總體來看，桑葚超氧陰離子清除率在產地和品種之間的差異具有統計學意義（Plt;0.01）。從品種方面來看，白桑的超氧陰離子清除率比黑桑和藥桑低。從地區方面看，黑桑在吐魯番地區的超氧陰離子清除率最高，其次是喀什地區。藥桑在阿克蘇地區的超氧陰離子清除率最高，其次是和田地區。

2.5新疆桑葚總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析結果顯示，桑葚的總抗氧化能力（ABTS法）、DPPH自由基清除率及超氧陰離子的清除率之間呈正相關（Plt;0.01），且相關系數均大于0.7，表明這三種抗氧化活性實驗可以相互佐證。桑葚總黃酮含量分別與ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除率及超氧陰離子的清除率呈正相關（Plt;0.01），相關系數分別為0.908、0.975和0.867，表明桑葚總黃酮含量與抗氧化活性密切相關。這與既往研究一致[29]。說明隨著樣品溶液中總黃酮含量的增高，其抗氧化活性越強。3結論

本研究在單因素試驗的基礎上，應用響應曲面分析方法對桑葚總黃酮的提取工藝條件進行了優化，得到最佳條件為體積分數84%，超聲時間81 min，料液比 1∶11（g/mL），在此最優條件下，從桑葚中提取的總黃酮量為（1.78±0.10） mg/g，與理論值較為吻合，說明該模型能夠較好地預測桑葚總黃酮的提取量，提取工藝準確可行。桑葚總黃酮含量與抗氧化活性密切相關，白桑的總黃酮含量和抗氧化活性都比黑桑和藥桑低；黑桑總黃酮含量和抗氧化活性在吐魯番地區與喀什地區的較高；藥桑總黃酮含量和抗氧化活性在阿克蘇地區與和田地區較高。因此，本研究可為后續新疆桑葚的資源開發、食品加工等提供一定的數據支持。參考文獻：

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