茶葉斑病病原菌的鑒定及生長特性研究

摘要：本研究從貴州余慶茶葉產區的茶樹葉部病害樣品中分離純化出多個相似的分離物，觀察其菌落、分生孢子器和分生孢子等形態。測定了LSU、ITS和TUB等核酸序列，采用PAUP軟件及最大簡約法，進行多基因系統發育樹分析。依據柯赫氏法則，完成代表性菌株CGMCC3.20149在室內和自然條件下的茶樹葉片致病性研究。同時，還探究了菌株CGMCC3.20149在不同培養基上的生長速率。結果表明，CGMCC3.20149菌株的菌落、分生孢子器和分生孢子等形態與荸薺點霉稈枯病菌Didymellabellidis一致；CGMCC3.20149菌株與模式菌株D.bellidisPD94/886和D.bellidisCBS714.85在系統發育樹上聚為一支，自舉支持率為100%；通過損傷方式接種，CGMCC3.20149菌株可引起茶樹葉片產生病斑；在OA培養基上的生長速率最快，達（0.76±0.01）cm/d，PDA培養基上的生長速率次之，為（0.73±0.02）cm/d，MEA培養基上的生長速率則最慢，為（0.62±0.01）cm/d；不同的碳素營養和氮素營養均影響菌絲的生長速率、菌素豐度、色素形成；25℃是菌株體外最適宜的生長溫度；菌株在pH6～9的范圍內生長較好。

關鍵詞：茶葉斑病；荸薺莖點霉稈枯病菌；鑒定；生物學研究；致病性

中圖分類號：S432

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0010－08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.002

貴州在茶樹種植上具備低緯度、高海拔、寡日照、多云霧、無污染的生態優勢。近年來，貴州大力發展茶產業，種茶面積位居全國第一［1］。由于茶樹為多年生作物，其種植生態氣候條件多樣，病害的發生流行途徑復雜，茶樹病害是影響茶葉生產的重要影響因素。據報道，全球茶樹病害多達500余種，我國記載有138種，其中真菌病害高達72種［1-4］。隨著種植結構的調整、全球氣候的變化以及對茶樹病原鑒定技術的進步，不斷有新的病原和病害報道。例如，新發現茶云紋葉枯病的病原膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichumacutatum）、茶輪斑病的病原茶假擬盤多毛孢（Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis）、新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsisclavispora）、廬山擬盤多毛孢（Pestalotiopsislushanensis）和Pestalotiopsiscamelliae，茶葉斑病的病原莖點霉屬（Didymellasegeticolavar.camelliae）、荸薺莖點霉稈枯病菌（Didymellabellidis）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodiatheobromae）、高粱附球菌（Epicoccumsorghinum）、茶褐枯病的病原菌（Colletotrichumcamelliae）［5-15］。本團隊在貴州省余慶縣松煙鎮茶區進行全年不間斷的調查，發現茶葉斑病的發生率較高。其中，嫩葉和嫩稍處的病害發病率最高，病斑癥狀為褐色的針尖形，而后逐漸擴大為1mm左右；隨著病斑擴大，病斑周圍有時還伴隨出現黃色暈圈，直至病斑面積長至約1.5mm則不再擴大。田間調查發現，茶葉斑病的發病率較高，達74%～82%，并且嚴重度為42%～48%。因此，為了探明其病原菌，進而提出有效的防控措施預防該區域茶葉斑病的病害發生，本文對貴州省余慶縣松煙鎮二龍茶區的茶葉斑病進行了病原菌鑒定和生物學特性的初步研究。

1材料與方法

1.1樣品采集

2018年3月至11月，在貴州省余慶縣松煙鎮二龍村（E107°36′，N27°38′，海拔860m）12個茶園采集發生典型葉斑病病害癥狀的茶樹葉片，并記錄茶樹葉斑病病害發生特征。采集的試驗樣品主要為樹齡5年至7年的福鼎大白茶（Camelliasinensiscv.Fuding-dabaicha）。

1.2菌株的分離和純化

將采集到的自然發病茶樹病葉帶回實驗室，采用組織法分離茶樹病害葉片樣本病原菌［10，13］。將從同一茶樹葉片分離得到的30余個純化的菌株接種至裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potatodextroseagar，PDA）的保種管，待菌株生長良好，添加滅菌的石蠟覆蓋菌株，保存于病害樣本儲存室的4℃冰箱中。同時，代表性菌株GZYQYQX1A已送至中國普通微生物菌種保藏管理中心進行保存，菌株保藏號為CGMCC3.20149。

1.3形態學觀察

選取菌株CGMCC3.20149接種到PDA上培養活化，并將菌餅接種至PDA、麥芽浸粉瓊脂培養基（MaltExtractAgar，MEA）和燕麥片瓊脂培養基（OatmealAgar，OA）。在溫度25℃，光照為黑暗條件下培養7d。每天觀察并記錄菌株PDA、MEA和OA培養基上的菌落生長情況、形態特征、菌絲豐富度及色素分泌特征，并計算菌落生長速率。同時，將滅菌的松針置于PDA培養基誘導病原菌產孢，觀察菌株的產孢特征。待產孢后，采用奧林巴斯顯微鏡（Olympus，BX43和FVMPE-RS）觀察并記錄菌株的產孢結構和分生孢子形態特征［11，16-17］。

1.4致病性試驗

根據趙曉珍等［10］和任亞峰等［13］的試驗方法，將分離獲得的菌株接種至茶樹葉片進行致病性測定。致病性試驗包括室內致病性試驗和田間致病性試驗，試驗品種為‘福鼎大白茶’，‘福鼎大白茶’種植于本實驗室大棚溫室，茶樹樹齡約5年，接種葉為第2葉和第3葉。田間致病性試驗在貴州省惠水縣七里沖茶場（106°61′E，26°08′N，海拔966m）完成，茶樹樹齡約30年，選取至少30d內未施用農藥的茶園區域進行試驗。接種病原為菌碟和分生孢子液。菌碟使用直徑6mm的打孔器打取，從分生孢子器中獲取分生孢子液，濃度調整為106個/mL，接種量為20～30μL。接種葉片為第3葉或第4葉，每個處理設3個重復，每個重復在15棵茶樹上完成。

1.5病原菌的分子生物學鑒定

DNA提取根據Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒及使用說明進行。使用LR0R/LR7、V9G/ITS4、TUB2Fd/TUB4Rd引物，分別擴增內轉錄間隔區（Theinternaltranscribedspacer，ITS）、28S大亞單位rDNA（thepartial28SlargesubunitrDNA，LSU）、β-微管蛋白基因（beta-tubulin，TUB）的基因或核酸片段［18-21］。選用HS-Taq聚合酶進行PCR擴增。

采用EZNA凝膠提取試劑盒（OMEGABio-tek，Madison，WI，USA）將PCR擴增產物進行純化。PCR純化產物采用T4-DNA連接酶試劑（pGEM-TEasy載體系統，美國Promega）連接至pGEM-T載體，并轉到Trans1-T1PhageResistant化學感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司）中，然后挑取單克隆菌落。采用M13F/M13R引物挑選陽性克隆，并采用質粒測序。代表性菌株的PCR擴增產物序列提交至Genbank。通過BLAST比對，選擇參比序列。采用PAUPv4.0b10（Swofford2003）及最大簡約法（MaximumParsimony，MP）進行聚類分析及進化樹構建，系統發育樹參數為：Consistencyindex（CI）=0.7715，Homoplasyindex（HI）=0.2285，Retentionindex（RI）=0.6141，Rescaledconsistencyindex（RC）=0.4738，樹長為407。LSU、ITS和TUB基因的系統發育樹分析方法選擇Bootstrap，對LSU（1-860）、ITS（861-1358）和TUB（1359-1695）進行串聯加合，總長為1695，162個變異位點（variablecharacters，VC）是簡約信息位點（parsimony-uninformative），信息位點數（parsimony-informativecharacters）為102個，重復次數為1000，最大的樹數目（Maxtree）設置為10000。

1.6菌株生長特性的測定

1.6.1不同培養基的影響

采用包興濤等［22］和王雪等［23］的試驗方法，研究菌株CGMCC3.20149在PDA、OA和MEA培養基上的生長速率、菌落形態和菌絲色素，以及在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（PotatoDextroseBroth，PDB）中的生長情況。菌株生長于25℃和黑暗條件。接種菌碟至100mLPDB中，置于25℃、180r/min恒溫搖床培養。每12h采用中速濾紙對1組樣品進行菌絲過濾，然后置于60℃烘箱中烘干至恒重并稱重［16］。每個處理重復5次，并獨立重復3次試驗。

1.6.2不同pH的影響

采用包興濤等［22］和王雪等［23］的試驗方法，pH從5增加至11，配制7個不同pH值的PDA培養基。研究培養基的pH值對菌株生長的影響。每個處理設5個重復。試驗重復3次。

1.6.3不同溫度的影響

將菌株CGMCC3.20149接種至PDA培養基上并在不同溫度下培養，溫度條件在19～34℃內共設置6種處理，待其中生長速率最快的處理接近長滿平板后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落的生長速率［22］。每種處理設5次重復，試驗獨立重復3次。

1.6.4不同氮源或碳源的影響

以察氏培養基（Czapek-DoxMedium）為基礎培養基，分別用葡萄糖、D-果糖、淀粉、山梨糖、乳糖、甘油等量代替基礎培養基中的蔗糖，作為不同碳源培養基；分別用甘氨酸、組氨酸、硫氨酸、尿素、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甲硫氨酸等量代替基礎培養基中的硝酸鉀，作為不同氮源培養基；將活化的菌株CGMCC3.20149接種至不同處理的培養基，置于25℃恒溫培養箱中培養，觀察并記錄菌落生長情況、形態特征及培養基變化情況，并記錄菌落直徑［16］。每個處理重復5次，并獨立重復3次試驗。

1.7數據統計與分析

使用SPSS19.0軟件進行統計分析。采用方差分析（ANOVA），以最小顯著法（Least-significantdifference，LSD）分析不同處理組間的差異顯著性。以不同小寫字母標識差異是否顯著。

2結果與分析

2.1茶葉斑病的田間癥狀

茶葉斑病一般發于葉片邊緣。茶葉葉片發生病害初期的顏色為淡褐色，然后逐漸擴大為1～2mm的圓形病斑。病斑周圍為淡黃色的暈圈，中部則為淺黃色。

病斑好發于嫩芽、嫩梢。隨著葉齡的增長，面積也逐漸擴大，直徑增至2mm左右，面積不再發生變化。同時相鄰的病斑經過發展可能融合為較大的病斑，這種現象尤其在嫩梢上較為突顯，因此導致發生病害的茶樹樹勢衰弱，降低新的芽葉抽發，嚴重損害茶葉產量（圖1）。

2.2菌株分離純化

采用組織分離法，從采集的樣本中分離出18個菌株。其中包括：Pseudopestalotiopsistheae、鏈格孢屬病原（Alternariaspp.）、亞隔孢殼屬（Didymellasp.）、莖點霉屬（Phomasp.）等菌株，并且Pseudopestalotiopsistheae菌株的分離率達79.4%。

2.3茶樹葉斑病病原菌鑒定

2.3.1形態學特征

在25℃的黑暗條件下，接種菌株至3種培養基上22d，可見有分生孢子器產生。分生孢子器呈球形或不規則形，黑色，分散和成簇半浸沒在培養基上（圖2-a、b）。分生孢子器大小約50～290μm，由2至3層細胞構成，含有1～2個孔口，乳突不明顯（圖2-a、b）。分生孢子為單細胞，淡藍色，橢圓形或卵圓形，兩端較圓，大小（6.12±1.11）μm×（2.93±0.56）μm（n=50），含有0～2個油球（圖2-c）。

2.3.2病原菌的致病性

室內致病性試驗表明，茶樹葉片接種菌碟2d后便形成明顯的4～6mm病斑（圖3-a）；接種5d后，病斑面積持續擴大（圖3-b）。分生孢子懸浮液接種茶樹葉片5d后，接種位置形成較小的病斑，病斑直徑約3～5mm（圖3-c）。比較兩種接種方式，發現接種菌碟產生的癥狀重于接種分生孢子所產生的癥狀。田間致病性試驗表明，在接種菌碟2d后，茶樹葉片產生較大的病斑（圖3-d）。接種分生孢子懸浮液5d后，其病斑的大小顯著小于菌碟接種處理的病斑，接種點葉片顏色褪綠，呈淡黃色（圖3-e）。對照處理沒有產生病斑（圖3-f）。綜合比較室內致病和田間致病的癥狀，發現接種葉片的葉齡越低，產生癥狀的時間越早，葉片的癥狀也越重。

2.3.3病原菌的分子生物學鑒定

向Genbank提交菌株的基因或核酸的序列，序列登錄號分別為GZYQYQX1A：MN274966/LSU、MN274963/ITS、MN274969/TUB，GZYQYQX2B：MN274967/LSU、MN274964/ITS、MN274970/TUB，GZYQYQX3C：MN274968/LSU、MN274965/ITS、MN274971/TUB。根據系統發育樹分析，CGMCC3.20149菌株為荸薺莖點霉稈枯病菌D.bellidisPD94/886和D.bellidisCBS714.85，自舉支持率為100%（圖4）。外群為PleosporabetaeCBS523.66。

2.4病原菌生長特性

2.4.1pH對菌株生長的影響

試驗結果發現，CGMCC3.20149菌株最適生長的pH條件為9，其菌落生長速率最快，菌絲豐度最大。當pHlt;6或pHgt;9時，菌落的生長變緩（圖5）。但在不同pH條件下，菌落所分泌的色素沒有明顯差異，邊緣的菌絲均為白色或乳白色，菌落中央為淡黃色的菌絲。

2.4.2不同培養基上的生長特性

菌株CGMCC3.20149可在PDA、OA和MEA上生長。接種菌株至PDA，4d后的菌落正面呈灰白色，反面中央呈黃色（圖6-a、b）；7d后的菌落逐漸變為灰白色（圖6-c、d）；接種菌株22d后，菌落正面顏色逐漸加深，反面培養基基部有黑色色素分泌（圖6-e、f）。菌絲呈氣生狀，菌絲量較為豐富（圖6-c）。

接種菌株至MEA，4d后的菌落正面呈白色，反面外周呈黃色，中央顏色較深（圖6-g、h）；7d后，逐漸變為灰白色，反面呈黃色，培養基基部有色素分泌（圖6-i、j）；接種22d后，正面顏色逐漸加深，中央顏色變深（圖6-k、l）。

接種菌株至OA，4d后的菌落正面和反面均呈灰色，菌絲量不豐富（圖6-m、n）；7d后的菌落顏色逐漸變深（圖6-o、p）；22d后的正面和反面顏色變深褐色（圖6-q、r）。

試驗結果表明，致病菌株在OA培養基上生長速率最快，為（0.76±0.01）cm/d；在PDA培養基上的生長速率次之，為（0.73±0.02）cm/d。OA培養基和PDA培養基上的生長速率差異不顯著。在MEA培養基上生長最慢，生長速率為（0.62±0.01）cm/d（圖7）。

菌絲在PDB中的生長試驗表明，菌株在60～96h的時間范圍內，菌絲生長量最快。96h之后，菌絲生長量不再增加，推測與培養基的消耗、菌絲量的增加、代謝產物的產生、pH值的變化等因素有關（圖8）。

2.4.3不同溫度條件下的生長特性

不同溫度的試驗結果表明，菌株在22～25℃范圍內的生長速率較快。當溫度上升至28℃，菌株生長速率減緩。當溫度上升至34℃，菌株的生長停滯（圖9）。

2.4.4不同碳源和氮源對菌株生長的影響

試驗結果表明，在不同碳源培養基上菌株的生長速度具有差異。其中，生長速度最快的為含淀粉的培養條件（圖10-c；表1），在含山梨糖的培養條件下生長速度明顯較慢（圖10-e；表1）。菌絲豐度結果顯示，在含有葡萄糖、D-果糖、淀粉、蔗糖或乳糖等培養基上的菌絲豐度最高（圖10-a、b、c、d、f；表1），在含有山梨糖或甘油的培養基上的菌絲豐度較低（圖10-e、g）。在缺乏含碳培養基的條件下，菌絲發育稀疏，豐度最低（圖10-h；表1）。

菌株在含有蛋白胨、異亮氨酸或甘氨酸等培養基上的生長速度較快（圖11-a、e、h；表2）；在含有硫酸氨或賴氨酸的培養基上的生長速度相對較緩慢（圖11-c、f；表2）。菌株在不同氮源的培養基上可產生白色、乳白色、黃白色、灰白色、灰色或黑褐色的菌絲。此外，菌株在含有甘氨酸、組氨酸、尿素、異亮氨酸、賴氨酸、蛋白胨或硝酸鉀的培養基上菌絲豐度最高（圖11-a、b、d、e、f、g、h、圖10-d；表2），在含有硫酸銨、亮氨酸或甲硫氨酸的培養基上菌絲豐度較低（圖11-c、g、i；表2）。在缺乏含氮培養基的條件下，菌絲發育稀疏，豐度最低（圖11-j、表2）。

3結論與討論

本研究根據形態學、分子生物學、多基因系統發育樹和致病性試驗的方法，從貴州省余慶縣二龍茶區發生茶樹葉斑病的葉片中發現致病菌D.bellidis。基于多基因系統發育樹的方法，Wang等［11］構建Didymellaceae的系統發育樹，將D.bellidis歸到Didymella中。本研究將D.bellidis鑒定為D.bellidisPD94/886和D.bellidisCBS714.85。同時，發育樹顯示，D.bellidis與Didymellasegeticola在發育樹上處于鄰近的位置［23］。研究表明，D.bellidisCBS714.85在芬蘭的雛菊（Bellisperennis）上發現，可引起雛菊產生葉斑病［24］。后來，陸續有研究表明，D.bellidis可引起荸薺（Eleocharisdulcis）、白芷（Angelicadahurica）、除蟲菊（Tanacetumcinerariifolium）、杭菊（Chrysanthemummorifolium）、獼猴桃（Actinidiachinensis）和茶樹（Camelliasinensis）等產生葉斑病［25-30］。此外，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）也會引起植物葉斑病［31］。發生植物病害會嚴重影響農產品產量和品質［32］，因此對致病菌的篩選以及病害機制仍需進一步研究。

研究表明，茶葉斑病的病原菌種類較多，且病害的發生流行機制尚不明確。茶樹發生葉斑病的規律可能存在多種類型。（1）病原菌種類：一種病原菌引起的病害；由多種致病菌協同引起的病害；由致病菌和非致病菌（例如，內生菌）協同引起的病害。（2）侵入途徑：機械損傷導致病原的侵入；害蟲取食后對葉片的損傷，繼發真菌的侵染和繁殖。在茶葉斑病的病原菌鑒定上，本團隊已經從貴州省多個發生葉斑病病害的茶區分離出不同種類的病原菌，如：D.segeticolavar.camelliae［10］、茶擬盤多毛孢菌（P.theae）［33］、長柄鏈格孢菌（Alternarialongipes）［34］、杜仲黑斑病菌（Pestalotiopsistrachicarpicola）［35］和高粱附球菌（E.sorghinum）［36］等，以及部分內生菌、弱致病菌。綜合比較前期的研究結果，發現上述病原菌可產生葉斑的癥狀，但在癥狀產生時間、癥狀輕重程度、癥狀表現等方面存在差異。可能與病原菌的致病力、寄主對病原菌的抗性、致病菌與茶樹微生物種群等因素有關，本研究可為荸薺莖點霉稈枯病菌所致茶葉斑病的致病機制研究及田間防治提供重要的參考依據。

（責任編輯：嚴秀芳）

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