黃連素通過TLR4途徑對大鼠脊髓損傷后神經功能的影響及相關機制研究

李艷兵

(恩施土家族苗族自治州中心醫院脊柱外科,湖北恩施 445000)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)會導致神經元功能障礙,嚴重損害了人類健康[1]。有研究指出,炎癥反應導致的細胞凋亡在SCI繼發性損傷的病理過程中起關鍵作用,針對性減少的繼發性炎癥反應可有效促進SCI后的神經元恢復[2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)相關通路會在SCI繼發性損傷過程中激活,并誘導炎性反應[3]。黃連素是一種異喹啉類生物堿,具有多種生化功能,包括調節抗炎作用、淋巴細胞免疫調節等,最新的研究顯示,黃連素可以通過抑制線粒體損傷以緩解大鼠的SCI損傷,但是其機制尚不清楚[4]。有研究發現,黃連素可以通過抑制TLR4信號通路調節腸道菌群并降低胰島素抵抗[5]。鑒于此,本文主要分析黃連素通過TLR4途徑對大鼠SCI后神經功能的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和器材

健康SD大鼠(清潔級,雄性,260～300 g,南京醫科大學動物實驗中心)。黃連素(Sigma公司,美國)。ELISA試劑盒(碧云天公司)。Trizol試劑(Invitrogen公司,美國)。逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司,瑞士)。RIPA裂解緩沖液(中國,北京,Beyotime)。BCA蛋白測定試劑盒(北京Applygen公司,中國)。anti-Bcl2、anti-caspase3、anti-Bax、anti-TLR4、anti-MyD88和二抗(Abcam公司,美國)。ECL試劑盒(Amersham,美國)。

1.2 大鼠分組、建模和干預方法

將36只大鼠隨機分為3組各12只:對照組、SCI組和SCI+黃連素組。SCI組和SCI+黃連素組根據參考文獻[6]建立SCI模型,具體方法如下:①通過腹膜內注射2%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,然后將大鼠俯臥固定置于立體定向框架中。在脊柱正上方作切口,并進行椎板切除術以暴露大鼠的T10胸椎。然后將重量為10 g的撞擊器從20 mm高處垂直掉落到裸露的脊椎上建立SCI,縫合傷口。然后進行常規抗感染處理,每天注射80000U的青霉素,連續7 d。每天至少按摩2次以促進排泄。②對照組僅進行暴露脊椎和縫合。③SCI+黃連素組在建模后,使用黃連素灌胃[4],劑量為5 mg/100 g,每日1次,干預7 d。對照組和SCI組大鼠使用等量的生理鹽水灌胃。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 運動功能評價

通過Basso, Beattie and Bresnahan(BBB)運動功能評分法[7]評估運動功能,評估項目包括肢體功能、協調程度、踩踏能力和軀干穩定性。BBB評分范圍為0(表明沒有可觀察到的后肢運動)～21分(表明在正常的后肢運動)。分別在建模前、建模后1 d和7 d進行評估。

1.3.2 ELISA檢測血清炎性因子水平

通過剪尾收集大鼠外周血液樣本,離心收集上層血清,根據說明書加入抗體和顯色劑,利用酶標儀檢測450 nm下的吸光度,通過標準曲線計算TLR4通路相關炎性因子的濃度,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)。

1.3.3 Westernblot

將脊髓組織裂解、萃取總蛋白,BCA法計算濃度,將40 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(PAGE)(80～120 V,90 min)分離。在100 mV的恒定電壓下,與PVDF膜進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。將1:500稀釋的anti-Bcl2、anti-caspase3、anti-Bax、anti-TLR4和anti-MyD88添加到PVDF膜中,并在4°C下孵育過夜。洗滌后,在室溫下添加二抗孵育1 h,然后加入ECL試劑盒進行顯影。GAPDH作為內參,用Image J軟件分析目標條帶的灰度值,計算蛋白相對表達水平。

1.4 統計學處理

2 結果

建模前,各組大鼠BBB評分均為21分,提示運動功能正常;建模后1 d,SCI組和SCI+黃連素組的BBB評分顯著降低(P<0.05),提示建模成功。

建模后7 d,各指標如下:SCI組的BBB評分SCI+黃連素組>對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。SCI組的Bax、caspase3、TLR4、MyD88水平>SCI+黃連素組>對照組(P<0.05),而SCI組的Bcl2水平

表1 黃連素對SCI大鼠模型BBB評分的影響

表2 黃連素對SCI大鼠模型血清TNF-α和IL-6的影響

表3 黃連素對SCI大鼠模型脊髓組織中凋亡蛋白Bax、caspase3、Bcl2水平的影響

表4 黃連素對SCI大鼠模型脊髓組織中TLR4、MyD88水平的影響

圖1 Western blot檢測黃連素對SCI大鼠模型脊髓組織中凋亡蛋白Bax、caspase3、Bcl2水平的影響

圖2 Western blot檢測黃連素對SCI大鼠模型脊髓組織中TLR4通路的影響

3 討論

SCI繼發性損傷是在原發性損傷之后,由于氧化應激、炎性反應、免疫功能障礙和神經元凋亡等引起的損傷,在此過程中,神經元的損傷是可逆的[8]。目前尚無治療SCI的特效方法,中藥因具有較好的療效和較低的不良反應,在SCI的治療中獲得了關注。

黃連素是中草藥黃連的主要活性單體,其分子式是C20H19NO5,分子量為353.36,研究顯示,黃連素具有神經保護、抗炎和抗氧化作用,動物實驗結果顯示,黃連素可以促進大鼠脊髓根部撕脫再植入后運動神經元的存活和軸突再生[9]。岳旭珂等[10]研究顯示,黃連素可以抑制SCI損傷后的細胞凋亡。本次研究顯示,黃連素可以顯著提高SCI大鼠模型的BBB評分,改善神經功能,并減少凋亡蛋白caspase3和Bax的表達,誘導抗凋亡蛋白Bcl2的上調。鮑和等[11]的研究顯示,黃連素可以保護β-淀粉樣蛋白以減輕神經元損傷。也有研究顯示,黃連素可以通過抑制心肌細胞凋亡緩解缺氧/復氧對心肌的損傷[12]。這提示在SCI模型中,黃連素可以通過抑制脊髓中神經元的凋亡緩解神經功能損傷。

為進一步分析黃連素抑制SCI大鼠模型脊髓中細胞凋亡的機制,本研究檢測了TLR4通路及其相關炎性因子的水平。TLR4通路是非特異性免疫的重要通路,與損傷密切相關,機體在受到氧化應激、脂多糖、炎性反應的作用下,TLR4相關通路被激活,并且會通過下游信號的轉導,誘導促炎因子的大量表達并誘導細胞凋亡。有研究已經顯示,TLR4相關通路在SCI后的繼發性損傷過程中被激活,進而引起下游炎性因子TNF-α和IL-6的水平升高,使脊髓神經元發生炎性損傷和凋亡[13]。本研究結果顯示SCI組的TNF-α、IL-6和TLR4水平顯著高于對照組,SCI+黃連素組的TNF-α、IL-6和TLR4水平顯著低于SCI組。有研究顯示,通過微小RNA-27a抑制TLR4通路可以使TNF-α等炎性細胞因子的水平明顯降低,從而緩解SCI損傷[14]。Zhang等[15]的研究也顯示,抑制TLR4通路對于改善炎性反應、緩解神經元凋亡,具有重要的作用。此外,黃連素可以通過抗炎作用保護顱腦外傷的小鼠的繼發性損傷,并保護小鼠的神經功能[16]。Wang等[17]的研究顯示,黃連素可以通過抑制促炎因子的表達,并觸發少突膠質細胞自噬,保護神經元免受損害。這提示在SCI中,TLR4引起的炎性反應和神經元損傷是誘導神經元凋亡的重要因素,而黃連素可能通過抑制TLR4通路和炎性反應,減少SCI大鼠模型神經元凋亡,從而保護SCI后的神經損傷。

綜上所述,黃連素可以通過抑制TLR4通路和炎性因子的水平抑制脊髓中神經元凋亡,從而保護SCI大鼠模型的神經功能。關于黃連素調節TLR4通路和炎性因子的機制,值得深入研究。