CXCR3及其配體對脊柱結核的診斷價值

李汶諭

(鶴壁煤業(集團)有限責任公司總醫院骨科,河南鶴壁 458030)

結核分枝桿菌主要通過呼吸道傳播,感染后可通過血液到達骨骼和消化系統等身體多個系統,脊柱結核(spinal tuberculosis,ST)是常見的肺外結核類型,約占肺外結核發病率的50%[1]。臨床上ST的診斷比肺結核更具有挑戰性,穿刺病理檢查和成像雖然可輔助診斷ST,但病理檢查屬有創檢查,而包括磁共振在內的影像檢查的特異性較低[2]。因此,探討輔助診斷ST的生物標記物對ST的診斷、治療監測和預后評估具有重要作用。輔助性T細胞1型(helper T cell type 1,Th1)細胞介導的免疫在結核病耐藥中發揮主導作用,CXC趨化因子受體3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)系統在Th1細胞介導的免疫中發揮重要作用。CXCR3配體包括三種趨化因子:趨化因子CXC配體9(chemokine CXC ligand 9,CXCL9),由IFN-c誘導的單因子;趨化因子CXC配體10(chemokine CXC ligand 10,CXCL10),由IFN-c誘導的10kDa蛋白;CXCL11,IFN誘導的T細胞趨化劑[3]。這些趨化因子誘導CD4效應T細胞運輸到感染部位。CXCL10作為結核病的生物標志物已經得到相關研究證實[4],但CXCL9、CXCL10對ST的診斷價值較少見報道。本研究觀察了ST和非ST患者血清CXCR3配體水平及CXCR3配體對ST的診斷價值,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經醫院倫理委員會批準,選擇2019年1月～2021年6月在本院就診的53例ST患者作為研究組。納入標準:具有典型結核感染癥狀,且出現脊髓壓迫癥狀,經病理學確診為ST;年齡18～65歲;患者對研究知情并簽署知情同意書。排除患有其他免疫疾病、腫瘤疾病、HIV感染或代謝紊亂者。按年齡“±2歲”、性別相同、1∶1匹配的原則,抽取同期在本院接受健康體檢的53例受試者作為對照組。對照組患者沒有任何活動性結核史或近期與任何活動性結核患者密切接觸史。兩組受試者的一般資料差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組受試者一般資料比較

1.2 研究方法

所有受試者均于清晨空腹抽取外周靜脈血10 mL,分2管存放,每管5 mL。用于酶聯免疫吸附法檢測的靜脈血置室溫放置2 h,以3000 r/min的速度離心15 min,分離血清在-80 ℃進行儲存;檢測前從冰箱中取出待測樣品,室溫下放置60 min,采用ELISA法檢測CXCR3及CXCL9、CXCL10、IFN-γ水平,嚴格按照操作說明書操作,試劑購自賽默飛世爾。另取5 mL靜脈血行紅細胞溶解,使用TRIzol試劑從白細胞中提取總RNA,根據反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit(賽默飛世爾公司)操作說明通過反轉錄合成cDNA。RT-qPCR反應體系:2 μL cDNA、1 μL正向引物,1 μL反向引物,12.5 μL的TB Green Premix Ex Taq和8.5 μL的DEPC。PCR反應參數:預變性95 ℃30 s,1個循環;PCR95 ℃5 s,60 ℃30 s,40個循環;采用GAPDH作為內參,采用比較循環抑制法(2-ΔΔq)計算相對表達量。引物序列:GAPDH:正向5’-CATCCACTGGTGCTGCCAAGGCTGT-3’,反向5’-ACAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCCA-3’;CXCR3:正向5’-ATGCGAGAGAAGCAGCCTTT-3’,反向:5’-TCCTATAACTGTCCCCGCCA-3’;CXCL9:正向5’-GAAGCAGCCAAGTCGGTTAGTG-3’,反向5’-AATCATCAGCAGTGTGAGCAGTG-3’;CXCL10:正向5’-TGGCATTCAAGGAGTACCTC-3’,反向5’-TTGTAGCAATGATCTCAACACG-3’;IFN-γ:正向5’-CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA-3’,反向5’-ACAGTTCAGCCATCACTTGGA-3’。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析,計量資料采用獨立樣本t檢驗(正態分布資料)或非參數檢驗(非正態分布資料);計數資料采用卡方檢驗,采用ROC曲線計算不同指標診斷ST的靈敏度、特異性、最佳截斷值(cut-off)、曲線下面積(area under curve,AUC)和95%CI,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

研究組患者的血清CXCL3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ水平及其mRNA表達水平均顯著高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2-3。

表2 兩組受試者血清IFN-γ、CXCL3及配體表達水平相比較(pg/mL)

血清IFN、CXCL3、CXCL9、IFN-γ診斷ST的靈敏度分別為88.7%、84.9%、88.7%、81.1%,特異性分別為88.7%、96.2%、94.3%、94.3%,AUC分別為0.933、0.915、0.961、0.918。見表4和圖1。

圖1 血清IFN-γ、CXCL3及配體診斷ST的ROC曲線

表4 血清IFN-γ、CXCL3及配體診斷ST的臨床價值

外周血IFN、CXCL3、CXCL9和IFN-γ的mRNA水平診斷ST的靈敏度分別為81.1%、81.1%、86.8%和84.9%,特異性分別為73.6%、96.2%、98.1%和88.7%,AUC分別為0.829、0.926、0.921和0.935。見表5和圖2。

表3 兩組受試者外周血中IFN-γ、CXCL3和配體mRNA表達水平比較

表5 外周血中IFN-γ、CXCL3和配體mRNA表達水平診斷ST的臨床價值

圖2 外周血中IFN-γ、CXCL3和配體mRNA水平診斷ST的ROC曲線

3 討論

ST是最常見的骨關節結核,其病因是結核分枝桿菌入侵宿主,繁殖并通過血液和淋巴管傳播到椎體邊緣,導致椎體或椎間盤破壞、脊柱畸形、功能障礙、截癱甚至死亡[5]。結核分枝桿菌感染的免疫反應主要是細胞介導的免疫反應,在此期間,特異性Th1細胞被結核分枝桿菌抗原致敏,產生IFN-γ。IFN-γ是細胞抵抗結核分枝桿菌感染的重要因子,可誘導趨化因子發揮作用,導致巨噬細胞激活,從而發揮抗結核分枝桿菌的免疫作用[6]。

趨化因子受體主要表達于骨髓中的各種白細胞、上皮細胞和血管內皮細胞等,可調節白細胞在組織中的轉運和細胞歸巢,在免疫細胞和免疫器官的發育、免疫反應、炎癥反應和病原體感染中發揮生理和病理作用[7]。CXCR3主要表達于活化的T淋巴細胞(特別是Th1細胞)、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等表面,是活化T細胞中重要的趨化因子受體,受到刺激時,在T細胞表面迅速上調并高度表達[8]。既往研究顯示,ST患者病灶區的CXCR3陽性表達面積高于對照組[9]。ST患者感染結核分枝桿菌后,T細胞能夠識別結核分枝桿菌并與其對抗,同時分泌IFN-γ,IFN-γ進一步誘導CXCR3配體產生,促進CXCR3和CXCR3配體在Th1細胞的結合,招募更多的Th1細胞進入炎癥部位以發揮炎癥作用。

CXCL9是趨化因子CXC亞族的一員,體內神經膠質細胞和巨噬細胞受到IFN-γ刺激產生CXCL9,其受體是CXCR3,在炎癥反應中發揮重要作用。CXCL9的趨化性主要由CXCR3介導,CXCL9和CXCR3結合后,CXCR3被激活,刺激Src磷酸化和Src激酶活性,并增加磷脂酰肌醇3激酶和AKT活性,參與炎癥反應的病理過程[10]。ST組中CXCR3和CXCL9表達增加,可能加強CXCR3和CXCL9結合,激活下游通路,增強結核分枝桿菌感染期間的炎癥反應[11]。CXCL10是CXC非ELR亞家族中的趨化因子之一,受IFN-γ刺激的細胞可直接分泌CXCL10,CXCL10選擇性激活T細胞中IFN-γ基因的表達,正反饋可招募更多T細胞,參與細胞生長、分化、凋亡和炎癥[12]。本研究中,ST組IFN-γ和CXCL10表達增加,與CXCL9的表達趨勢一致,這些結果提示CXCR3及其配體表達在ST中具有臨床意義。

既往一項研究顯示,CXCR3及其配體在肺結核的診斷中具有臨床意義[13]。本研究結果進一步提示了CXCR3及其配體在ST中的作用。本研究顯示,血清CXCR3、CXCL9、CXCL10、IFN-γ水平診斷ST的AUC均高于0.9,外周血CXCR3及其配體mRNA診斷ST的AUC均>0.8。理想的ROC曲線下面積為1,診斷性試驗中AUC在0.7～0.9之間的診斷價值中等,0.9以上時診斷價值高。本研究結果說明,血清CXCR3及其配體、外周血CXCR3及其配體mRNA診斷ST的臨床價值較高,外周血RT-qPCR獲得的CXCR3及其配體mRNA診斷價值不高于血清ELISA法結果,結果提示,ST患者可首選血清CXCR3及其配體而非RT-qPCR檢測進行診斷。

綜上所述,本研究顯示,ST患者的CXCR3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ高表達,血清CXCR3、CXCL9、CXCL10和IFN-γ水平可能是輔助診斷ST的有效方式。本研究的局限性在于:樣本量較少,且來自單中心;未來需要收集更多病例進行多中心研究,進一步論證研究結論。