溶酶體活性影響秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的作用

陸 芮, 劉 健, 林 燕

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)簡稱線蟲,作為一種模式生物,已經(jīng)被應(yīng)用于肥胖相關(guān)脂肪沉積的研究中。線蟲具有飼養(yǎng)條件簡單、生命周期較短、體積小、通體透明以及遺傳操作便利等優(yōu)點[1]。由于線蟲的身體是透明的,利用親脂染料(油紅O[2]、尼羅紅、蘇丹黑等)與脂滴特異性結(jié)合,可以直接觀察到線蟲體內(nèi)脂肪的儲存。在線蟲中,脂質(zhì)是以脂滴的形式儲存在腸道和皮下的細胞中[3]。由于脂滴是由單層磷脂膜包被的球形結(jié)構(gòu)[4],通過綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)記的脂滴特異性膜蛋白DHS-3,也可以直接觀察線蟲脂肪沉積水平[5]。此外,作為脂肪沉積研究模型,線蟲中還存在著大量與哺乳動物脂質(zhì)代謝相關(guān)的同源基因,保守地調(diào)控了線蟲脂肪代謝與能量穩(wěn)態(tài)。其中,與溶酶體活性直接相關(guān)的AMP-激活蛋白激酶(哺乳動物簡稱為AMPK,線蟲簡稱為AAK-2)和雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)等信號通路關(guān)鍵地調(diào)控了線蟲脂肪沉積[6-9]。

溶酶體作為一種高酸性的細胞器,含有多種水解酶,降解無功能的細胞器和蛋白質(zhì)等物質(zhì)維持細胞穩(wěn)態(tài)。然而,除降解功能外,溶酶體還參與多種細胞過程,包括營養(yǎng)感受、分泌、質(zhì)膜修復(fù)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝調(diào)控等[10]。有報道指出,溶酶體感應(yīng)細胞營養(yǎng)狀態(tài),激活溶酶體-細胞核信號,調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺乏反應(yīng)和能量代謝。在饑餓狀態(tài)下,肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)被募集到溶酶體膜上。作為核心細胞能量和營養(yǎng)感受器,AMPK被LKB1活化于溶酶體表面。此外,LKB1導(dǎo)致mTORC1與溶酶體的解離,抑制其活性,進而導(dǎo)致mTORC1依賴的轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)磷酸化降低,促進其跨核轉(zhuǎn)運,從而激活溶酶體生物合成和脂質(zhì)分解代謝相關(guān)基因表達[11-14]。在營養(yǎng)充足狀態(tài)下,mTORC1定位于溶酶體膜上,抑制TFEB的核定位,降低溶酶體生物發(fā)生和自噬[14-16]。因此,溶酶體參與了饑餓狀態(tài)下的營養(yǎng)感知和脂質(zhì)分解代謝。但是,關(guān)于溶酶體是否參與了營養(yǎng)過剩導(dǎo)致的脂肪合成的作用還不明確。

本文在標(biāo)準(zhǔn)線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)中補充1 mmol/L葡萄糖或0.02 mmol/L棕櫚酸來誘導(dǎo)線蟲的脂肪沉積。利用油紅O染色和LysoTracker Green染色檢測線蟲脂肪沉積和溶酶體活性的變化。利用溶酶體抑制劑氯喹和溶酶體生物合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子hlh-30(哺乳動物TFEB的同源基因)的突變體抑制線蟲溶酶體活性。利用線蟲溶酶體營養(yǎng)感應(yīng)和脂代謝相關(guān)信號關(guān)鍵分子aak-2、daf-15、rsks-1的突變體發(fā)現(xiàn),溶酶體通過mTORC1信號通路影響線蟲能量營養(yǎng)過剩所導(dǎo)致的脂肪沉積。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型(N2)線蟲,線蟲突變體RT258(unc119(ed3)Ⅲ;pwls50)、LIU1(ldrIs1[dhs-3p∶∶dhs-3∶∶GFP+unc-76(+)])、hlh-30(tm1978)、aak-2(ok524)、daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255),均購于國際線蟲中心(CaenorhabditisGenetic Center,CGC)。

1.2 主要試劑

膽固醇、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、油紅O、棕櫚酸、鏈霉素、左旋咪唑等均購于Sigma-Aldrich試劑公司;LysoTracker Green、瓊脂糖均購于Invitrogen試劑公司;甘油、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、無水乙醇、1,2丙二醇、次氯酸鈉、膽固醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖、甲醛等試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 線蟲生長培養(yǎng)基的配置

在本實驗中,除非特別注明,蠕蟲是在20 ℃的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的[17]。

標(biāo)準(zhǔn)NGM的配制。稱取3 g氯化鈉、2.5 g蛋白胨和17 g瓊脂粉,加入蒸餾水至1 L并混勻,121 ℃滅菌30 min。滅菌結(jié)束后,向上述培養(yǎng)基中加入過濾除菌的25 mL磷酸鉀緩沖液(pH 值為6.0)、1 mol/L氯化鈣、1 mol/L硫酸鎂和5 g/L膽固醇(溶劑為無水乙醇試劑)各1 mL,混合均勻。待溶液冷卻到60 ℃,加入1 mL的 30 g/L鏈霉素,混合均勻后倒入培養(yǎng)皿中,靜置凝固后備用。

補充葡萄糖NGM的配制。待上述標(biāo)準(zhǔn)NGM溶液溫度降至60 ℃左右時,將1 mL過濾除菌的1 mol/L葡萄糖母液,加入到1 L培養(yǎng)基中,混合均勻后,倒入培養(yǎng)皿中,靜置凝固后備用。

補充棕櫚酸NGM的配置。在上述標(biāo)準(zhǔn)NGM配制過程中,稱取0.005 g的棕櫚酸粉末,加入到NGM中,121 ℃滅菌30 min,冷卻凝固后備用。

1.3.2 線蟲的培養(yǎng)

將進入產(chǎn)卵期1～2 d的線蟲,用約1 mL M9緩沖液洗至1.5 mL的離心管內(nèi),多次清洗以除凈大腸桿菌,最后保留700 μL。在上述離心管中,加入300 μL現(xiàn)配的裂解液(5 mol/L氫氧化鈉與5%次氯酸鈉的體積比為1∶2)混勻。靜止2 min后,反復(fù)震蕩2～3次,直至2/3的線蟲裂解,6 000 r/min離心1.5 min,棄上清。裂解的卵用M9緩沖液洗3次后,于M9緩沖液中20 ℃孵化至L1期幼蟲。將L1時期線蟲,分別轉(zhuǎn)移到具有OP50大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)NGM、補充葡萄糖或棕櫚酸的NGM板上,于20 ℃培養(yǎng)至成蟲。

1.3.3 線蟲的油紅O染色

按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行油紅O染色,并稍加修改[3]。稱取0.5 g油紅O粉末溶于100 mL 1,2-丙二醇中,以配置0.5%油紅O染液,靜置1周后使用。染色前,油紅O溶液通過0.22 μm濾膜過濾。

用M9緩沖液,將成蟲從NGM板上沖洗到離心管中。在離心管中,加入1 mL M9緩沖液和50 μL 10%甲醛,-80 ℃放置10 min,反復(fù)凍融3次(第3次在冰上解凍1 h)。完全融化后,用預(yù)冷的M9緩沖液洗滌3次。最后,用1,2-丙二醇脫水5min,離心除去1,2-丙二醇,再加入1.5 mL油紅O染液,37 ℃恒溫,染色4 h。染色后,分別用98%、85%的1,2-丙二醇和M9緩沖液洗滌,滴加在2%的瓊脂糖墊上成像。至少對30只線蟲成像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)定量油紅O陽性面積比率。油紅O陽性面積比率指線蟲經(jīng)過親脂性染料油紅O染色所呈紅色區(qū)域占整只線蟲面積的比率。

1.3.4 線蟲的溶酶體綠色熒光染色

LysoTracker Green染色按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行,但略有修改[18]。將LysoTracker Green染料與過夜培養(yǎng)的OP50菌液以1∶1 000的比例混合,均勻涂布在NGM板上,37 ℃避光過夜。將L1時期線蟲置于NGM培養(yǎng)基上,20 ℃避光培養(yǎng)至成蟲。最后,將成蟲用50 μmol/L左旋咪唑麻醉,置于2%瓊脂糖墊上,使用尼康ECLIPSE E600顯微鏡對至少30只線蟲成像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)定量綠色熒光面積比率。綠色熒光面積比率指線蟲經(jīng)過LysoTracker Green染色所呈綠色熒光區(qū)域占整只線蟲面積的比率。

1.3.5 線蟲DHS-3∶∶GFP熒光拍照及定量

將DHS-3融合綠色熒光(DHS-3∶∶GFP)成蟲用50 μmol/L左旋咪唑麻醉,置于2%瓊脂糖墊上,使用尼康ECLIPSE E600顯微鏡對至少30只線蟲進行了成像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics)定量綠色熒光面積比率。綠色熒光面積比率指線蟲脂滴特異性膜蛋白DHS-3融合GFP表達面積占整只線蟲面積的比率。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)處理

文中所有的數(shù)據(jù)均為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),不同的樣本兩兩比較采用t檢驗,多組比較采用one-way ANOVA和two-way ANOVA,使用Prism 5.0版(GraphPad Software,CA,USA)進行統(tǒng)計分析。無營養(yǎng)物補充與葡萄糖或棕櫚酸補充比較,*、**、***分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001時結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。無抑制劑與氯喹處理比較、N2組與hlh-30(tm1978)比較,#、##、###分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001時結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)物對線蟲脂肪沉積的影響

為了研究營養(yǎng)物補充對線蟲脂肪沉積的影響,本文在標(biāo)準(zhǔn)NGM中補充1 mmol/L葡萄糖或0.02 mmol/L棕櫚酸來誘導(dǎo)L1時期線蟲,并觀察其脂肪沉積。本文利用油紅O染色發(fā)現(xiàn),葡萄糖或棕櫚酸的補充增加了N2線蟲的脂肪沉積水平,如圖1a所示。為了進一步驗證上述結(jié)果,使用脂滴蛋白DHS-3∶∶GFP標(biāo)記的線蟲LIU1檢測營養(yǎng)物對脂肪沉積的誘導(dǎo)作用,觀察到補充葡萄糖或棕櫚酸增加了DHS-3∶∶GFP的表達,如圖1b所示。結(jié)果表明,補充葡萄糖或棕櫚酸顯著增加了線蟲的脂肪沉積。

圖1 葡萄糖或棕櫚酸補充對線蟲脂肪沉積的影響

2.2 營養(yǎng)物對線蟲溶酶體數(shù)量和酸化的影響

溶酶體是一種高度酸化的細胞器,富含脂肪酶、核酸酶和蛋白酶等多種水解酶。這些溶酶體水解酶在pH=5.0時活性最佳[19]。LysoTracker Green是嗜酸性熒光探針,能通透細胞膜,用于活細胞內(nèi)酸性細胞器的標(biāo)記和示蹤[20]。因此,LysoTracker Green是一種溶酶體綠色熒光探針,可以用于活細胞溶酶體特異性熒光染色。為了明確溶酶體在營養(yǎng)過剩狀態(tài)下的感應(yīng)作用,本文利用LysoTracker Green染色檢測葡萄糖或棕櫚酸補充對N2線蟲溶酶體數(shù)量和酸化的影響,如圖2a所示。由圖2a可知,營養(yǎng)物補充后,隨著脂肪沉積的增加,線蟲的綠色熒光面積顯著增大,表明營養(yǎng)物的補充增加了溶酶體的數(shù)量和酸化。本文利用溶酶體膜蛋白LMP-1融合綠色熒光(LMP-1∶∶GFP)標(biāo)記的線蟲RT258來監(jiān)測溶酶體數(shù)量變化,也獲得了相似的結(jié)果,如圖2b所示。因此,溶酶體活性可能調(diào)控了營養(yǎng)物誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積。

圖2 補充葡萄糖或棕櫚酸對線蟲溶酶體數(shù)量和酸化的影響

2.3 溶酶體對線蟲脂肪沉積的影響

本文研究溶酶體活性抑制對營養(yǎng)物誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積的影響,如圖3所示。由圖3a可知,在N2線蟲中,氯喹(100 μmol/L)的處理顯著抑制了葡萄糖或棕櫚酸所導(dǎo)致的溶酶體數(shù)量和酸化的增加。

由圖3d可知,氯喹的處理也顯著抑制了葡萄糖或棕櫚酸所誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積增加。與上述結(jié)果相似,在RT258線蟲中,利用氯喹抑制溶酶體活性,也顯著降低了營養(yǎng)物誘導(dǎo)的脂肪沉積,如圖3b、圖3e所示。

在線蟲中,堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子HLH-30(helix-loop-helix transcription factor)是TFEB的同源蛋白,其響應(yīng)細胞的營養(yǎng)狀況,調(diào)控溶酶體生物合成和脂解相關(guān)基因表達[21]。

圖3 溶酶體抑制對營養(yǎng)物誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積的影響

本文利用hlh-30突變體降低溶酶體的生物合成,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于N2線蟲,hlh-30突變體顯著抑制了葡萄糖或棕櫚酸所誘導(dǎo)的溶酶體數(shù)量和酸化的增加,降低了線蟲的脂肪沉積,如圖3c、圖3f所示。因此,溶酶體活性關(guān)鍵地調(diào)控了營養(yǎng)物誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積。

2.4 mTORC1信號通路對線蟲脂肪沉積的影響

在線蟲中,一些保守的信號通路(如AMPK和mTORC1)已被證實參與了溶酶體營養(yǎng)狀態(tài)的感應(yīng)和線蟲脂肪沉積的調(diào)控[8-9]。為了探究溶酶體調(diào)控線蟲脂肪沉積所依賴的信號通路,本文利用這些信號通路關(guān)鍵分子的突變體aak-2(ok524)(AMPK信號相關(guān))、daf-15(ok1412)(mTORC1信號相關(guān))和rsks-1(ok1255)(mTORC1信號相關(guān))進行更深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與N2線蟲相比,aak-2(ok524)、daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255)突變體的溶酶體數(shù)量和酸化水平及其脂肪沉積都是降低的。與對照組N2線蟲相似,補充葡萄糖或棕櫚酸顯著增加了aak-2(ok524)突變體中溶酶體的數(shù)量和酸化,并且增加其脂肪沉積,如圖4所示。然而,在daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255)突變體中補充葡萄糖或棕櫚酸對溶酶體的數(shù)量、酸化以及脂肪沉積均沒有顯著作用。

這些現(xiàn)象與溶酶體抑制劑氯喹處理和hlh-30(tm1978)突變體抑制溶酶體活性、降低營養(yǎng)物誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積的結(jié)果相似,進一步說明溶酶體參與了調(diào)控營養(yǎng)物誘導(dǎo)的脂肪沉積。結(jié)果表明,溶酶體通過mTORC1信號通路影響線蟲能量營養(yǎng)過剩所導(dǎo)致的脂肪沉積。

圖4 mTORC1信號通路介導(dǎo)溶酶體對線蟲脂肪沉積的影響

3 結(jié) 論

本文將1 mmol/L葡萄糖或0.02 mmol/L棕櫚酸補充到標(biāo)準(zhǔn)NGM中誘導(dǎo)線蟲脂肪沉積。溶酶體作為營養(yǎng)再生中心,在感應(yīng)細胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)和細胞內(nèi)的能量檢測中發(fā)揮重要作用,隨著脂肪沉積的增加,線蟲溶酶體數(shù)量和酸化水平也顯著增強,結(jié)果說明溶酶體可能參與了營養(yǎng)物誘導(dǎo)的線蟲脂肪沉積。

本文利用溶酶體抑制劑氯喹和溶酶體生物合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子hlh-30(tm1978)的突變體,確定抑制溶酶體活性能夠降低線蟲脂肪的沉積。并利用aak-2(ok524)、daf-15(ok1412)和rsks-1(ok1255)等多種突變體發(fā)現(xiàn),溶酶體通過mTORC1信號通路影響線蟲能量營養(yǎng)過剩所導(dǎo)致的脂肪沉積。

細胞處于饑餓狀態(tài)下,細胞內(nèi)溶酶體生物合成相關(guān)的主要調(diào)節(jié)因子TFEB跨核轉(zhuǎn)運,進入細胞核內(nèi),促進溶酶體的生物合成,增加脂質(zhì)分解代謝相關(guān)基因表達[22]。在營養(yǎng)限制的情況下,肝細胞中的脂滴通過與溶酶體直接的穩(wěn)定接觸,將蛋白質(zhì)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到溶酶體中進行降解,從而維持肝內(nèi)脂質(zhì)平衡[23]。因此,溶酶體感應(yīng)細胞的饑餓狀態(tài),并參與了細胞的脂質(zhì)分解代謝。但是,關(guān)于溶酶體參與營養(yǎng)過剩導(dǎo)致脂肪合成的作用還不明確。本研究在線蟲中發(fā)現(xiàn)溶酶體活性在體內(nèi)調(diào)控營養(yǎng)過剩導(dǎo)致脂肪沉積的作用及其分子機制,豐富了溶酶體在營養(yǎng)感應(yīng)中的功能研究。