五倍子對凡納濱對蝦生長、抗氧化、非特異性免疫及腸道結構的影響

陳嘉聲，韋宏杰，楊奇慧，譚北平，陳宇航，林華杏

（1.廣東海洋大學/水產動物營養與飼料實驗室，廣東 湛江 524025；2.廣東德寧水產科技有限公司，廣東 佛山 528399）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長快，抗逆性強，養殖效益高，是我國廣受歡迎的海水養殖對象之一[1-2]。隨著對高產量的追求，對蝦集約化養殖疾病暴發風險不斷增大，病害問題隨之成為制約對蝦養殖業發展的關鍵因素之一[3]。因此，尋找新型免疫增強劑成為飼料業的研究熱點[4]。

五倍子（Galla chinensis,GC）主要由五倍子蚜寄生在漆樹科植物上產生的蟲癭形成，其活性成分由鞣質（又稱單寧酸或鞣酸）及沒食子酸組成[5]，有提高機體抗氧化能力[6-7]和抗菌抑菌[8]的作用。近年來，五倍子在畜禽飼料中已得到廣泛應用，可有效提高養殖畜禽的生長性能、抗氧化能力及腸道消化酶活性[9-11]。在水產動物上亦有報道，五倍子水提取物可抑制凡納濱對蝦體內副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的繁殖[12]；五倍子可提高奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂）[13]的生長性能，促進鳙（Aristichthys nobilis）腸道消化酶的分泌，并改善腸道黏膜結構[14]，有效提高草魚（Ctenopharyngodon idella）的免疫能力[15]。但有關五倍子對凡納濱對蝦生長性能、非特異性免疫和抗氧化指標及腸道組織結構的影響鮮有報道。本研究分析五倍子對凡納濱對蝦幼體生長性能、血清生化指標、肝胰腺抗氧化、非特異性免疫能力及腸道組織結構的影響，為五倍子在對蝦配合飼料中的應用提供理論基礎和科學依據。

1 材料方法

1.1 實驗飼料

基礎飼料主要以魚粉和豆粕等為主要蛋白源，以魚油等為脂肪源。根據預實驗結果，質量分數0.03%的五倍子效果較好，因此在基礎飼料中分別添加質量分數0.0%（對照）、0.02%（GC2）和0.04%（GC4）的五倍子（表1），配制成3組等氮等脂實驗飼料。各飼料原料粉碎過孔徑180 μm 的篩，微量成分采取逐級擴大法添加，利用V 型混合機（M-256，華南理工大學），與大宗原料混勻后，再與魚油和水充分混勻。用雙螺桿制粒機（F-75，華南理工大學）擠壓成1.0 mm 和1.5 mm 兩種粒徑的顆粒飼料，經后熟化、風干后密封放入-20 ℃冰箱中備用。

表1 實驗飼料組成及營養水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient level of experimental feed(dry matter basis) %

1.2 實驗設計與飼養管理

實驗在廣東海洋大學生物研究基地進行，實驗前用對照組飼料投喂1 周。選取健康、規格整齊[(0.40±0.00)g]的幼蝦480尾，隨機放入12只0.3 m3桶（3 組，每組4 個重復，每重復40 尾），分別投喂相應飼料8 周。初次日投喂量為對蝦幼體體質量的10%，每天7:00、11:00、17:00、21:00 定量投喂，投喂量根據飼料實際消耗量調整。實驗期間每天早上投料前換水1/3，維持水體溫度為(30.5±0.8)℃，溶氧不低于6 mg/L，鹽度為29～31，氨氮不高于0.02 mg/L，亞硝酸鹽質量濃度不高于0.10 mg/L，pH 7.5～8.0。

1.3 樣品采集與分析

養殖實驗結束后，停飼對蝦24 h。對各桶進行計數、稱質量，計算存活率（Survival rate，SR，%）、增重率（Weight gain rate，WGR，%）、特定生長率（Specific growth rate，SGR，%/d）、飼料系數（Feed conversion ratio，FCR）等生長性能指標。

式中，Nt和N0分別為終末和初始對蝦數量；mt和m0分別為終末和初始對蝦總體質量(g)；t為實驗時間（d）。

每桶隨機取蝦25 尾，5 尾對蝦用于全蝦體成分分析，即水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量測定；取對蝦10 尾，從圍心腔采血，室溫下靜置4 h，離心（3 500 r/min，10 min），取上層血清，儲存于-80 ℃待用，用于血清生化指標測定；取4尾對蝦腸道固定在40 g/L多聚甲醛中，用于制備H.E染色切片。其余對蝦迅速取出肝胰腺組織，置于-80°C冰箱保存備用。

全蝦常規營養成分參照文獻[16]檢測，水分測定使用105 ℃常壓干燥法(GB5009.4-2016)，粗蛋白含量測定采用杜馬斯定氮儀檢測（GB5009.5-2016)，粗脂肪測定使用乙醚抽提法（GB5009.6-2016)，粗灰分測定使用550 ℃灼燒法（GB5009.4-2016)。血清總蛋白（TP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量，谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）；肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）活性及總抗氧化能力（T-AOC）參照南京建成生物工程研究所的試劑盒方法改進。

用DS-Ri2（Nikon，日本）對腸道組織染色切片進行觀察和拍照，并通過NIS-Elements D（Version 4.3，Nikon，日本）測量腸壁厚度和絨毛高度。

1.4 數據分析

用統計軟件SPSS（Version 20.0，IBM，美國）分析數據，組間差異分析采用單因素方差分析（oneway ANOVA），如各處理間有顯著差異(P ＜0.05)，則進行鄧肯氏多重檢驗（Duncan's multiple range test），結果以平均值± 標準差表示。

2 結果分析

2.1 五倍子對凡納濱對蝦生長性能的影響

GC 添加組凡納濱對蝦WGR 和SGR 均顯著高于對照組(P ＜0.05)，且FCR 均顯著低于對照組(P ＜0.05)（表2）。

表2 飼料中添加五倍子對凡納濱對蝦生長的影響Table 2 Effects of dietary GC supplementation on growth performance for Litopenaeus vannamei

2.2 五倍子對凡納濱對蝦體成分的影響

GC 添加組凡納濱對蝦體蛋白質均顯著高于對照組（P ＜0.05），添加GC 對對蝦全體水分、粗脂肪及粗灰分均無顯著影響（P ＞0.05）（表3）。

表3 五倍子對凡納濱對蝦全蝦體成分的影響（干物質基礎）Table 3 Effects of dietary GC on body composition for Litopenaeus vannamei(dry matter basis) %

2.3 五倍子對凡納濱對蝦血清生化指標的影響

GC添加組凡納濱對蝦的血清TP含量顯著高于對照組（P ＜0.05）；GC4 組血清TG 含量顯著低于對照組，而GC2 組則與對照組無顯著性差異（P ＞0.05）；GC 添加組的血清TC 含量、AST 及ALT 活性與對照組無顯著差異（P ＞0.05）（表4）。

表4 五倍子對凡納濱對蝦血清生化指標的影響Table 4 Effects of dietary GC on serum biochemical indices for Litopenaeus vannamei

2.4 飼料中添加五倍子對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化、非特異性免疫能力的影響

飼料中添加GC 對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化指標影響顯著。對照組凡納濱對蝦肝胰腺SOD 及CAT 活性均顯著低于添加組（P ＜0.05），且添加組間無顯著差異（P ＞0.05）；對照組的肝胰腺T-AOC顯著低于GC添加組（P ＜0.05），且GC2組顯著高于其余兩組（P ＜0.05）(表5)。

表5 五倍子對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化及非特異性免疫的影響Table 5 Effects of dietary GC on antioxidant capacity and non-specific immune-enzyme activities of hepatopancreas for Litopenaeus vannamei

飼料中添加GC 可顯著提高凡納濱對蝦非特異性免疫酶活性（P ＜0.05），GC 添加組肝胰腺ACP 及LZM 活性顯著高于對照組（P ＜0.05），且添加組間無顯著差異（P ＞0.05）；對照組肝胰腺AKP 活性顯著低于GC 添加組，其中GC2 組活性最高且顯著高于其余兩組（P ＜0.05）（表5）。

2.5 五倍子對凡納濱對蝦腸道結構的影響

飼料中添加GC 顯著改善了凡納濱對蝦全腸結構（P ＜0.05），GC4組腸壁厚度（IWT）顯著高于對照組和GC2 組（P ＜0.05）；對照組絨毛高度（VH）顯著低于GC2 組和GC4 組，且添加組間無顯著差異（P ＞0.05）（表6）。圖1亦有類似結果。

表6 五倍子對凡納濱對蝦全腸結構的影響Table 6 Effects of dietary GC on intestinal morphology for Litopenaeus vannamei μm

圖1 飼料中添加五倍子對凡納濱對蝦全腸結構的影響Fig.1 Effects of dietary GC supplementation on intestinal structure for Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 五倍子對對蝦生長性能和體成分的影響

在飼料中添加適量五倍子可改善動物生長狀況和提高飼料轉化利用率[17]。珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）飼料中添加質量分數1%的五倍子可顯著提高其終末體質量（FBW）、WGR 和SGR，顯著降低FCR[18]。奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus♀×Oreochromis aureus♂)飼料中添加質量分數0.02%～0.04%五倍子顯著提高了FBW、WGR 和SGR[19]。飼料中添加質量分數1.7%五倍子提取物顯著提高了斷奶仔豬的平均日增重[10]。本研究中，添加質量分數0.02%～0.04%五倍子顯著提高了凡納濱對蝦的FBW、WGR和SGR，顯著降低FCR，且GC2 和GC4 組的凡納濱對蝦FBW、WGR、SGR 及FCR 無顯著差異，表明添加質量分數0.02%～0.04%五倍子對對蝦生長無不良影響。其原因可能是，五倍子對腸道的收斂作用使食糜在腸道中的停留時間更長，進而提高了飼料的利用效率，改善了生長性能[17]。

體組成是評價動物營養狀況和健康的重要指標之一[19]。水產動物飼料中添加質量分數0.09%的栗木單寧可顯著降低其粗脂肪含量，而對水分、粗蛋白和粗灰分則未產生影響[20]。添加質量分數1%～2%縮合單寧對日本花鱸（Lateolabrax japonicus）體成分影響不顯著[21]。單寧是五倍子中重要活性物質，本研究中，添加五倍子可顯著提高對蝦粗蛋白含量，與文獻[19-20]不一致，可能與研究物種和單寧含量不同有關。

3.2 五倍子對對蝦血清生化指標的影響

血清生化指標可反映動物的營養代謝功能及健康狀況[22]。添加質量分數0.02%～0.16%五倍子顯著提高了羅非魚血清血紅蛋白含量[13]。五倍子提取物可顯著降低高脂肪膳食飼喂大鼠的TC 和TG含量[23]。攝食補充五倍子提取物的肉雞肝臟中TC含量降低約12%[22]。飼喂五倍子提取物可顯著提高仔豬血清TP 含量[25-26]。本研究表明，飼料中添加質量分數0.02%～0.04%五倍子顯著提高了對蝦血清TP 含量，降低了血清TG 含量，與上述結果相似，表明五倍子提高了對蝦對蛋白質的利用和脂質的代謝。AST 與ALT 活性是衡量機體氨基酸代謝水平的重要指標，正常機體血清轉氨酶活性會維持在較低的水平，當肝功能異常時AST 和ALT 活性會顯著提高[27-28]。本研究表明，添加五倍子對血清AST 和ALT 活性影響不顯著，表明質量分數0.2%和0.4%五倍子不會對對蝦肝胰腺產生損傷，添加量在合理范圍內。

3.3 五倍子對對蝦肝胰腺非特異性免疫指標和抗氧化指標的影響

ACP和AKP均屬于溶酶體酶，與甲殼動物的免疫功能密不可分[29]。LZM 是水產動物非特異免疫系統的重要組成部分，可通過水解細胞壁導致細菌破裂而亡[30]。飼料中添加質量分數0.10%～0.15%水解單寧顯著提高了珍珠龍膽石斑魚肝臟中AKP和ACP 活性[18]。飼料中添加0.50%～2.00%水解單寧顯著提高了鳙血清AKP 和LZM 活性[31]；飼料中添加質量分數2.00%酵提五倍子顯著提高了鳙血清LZM 活性[32]。本研究中，添加質量分數0.02%～0.04%五倍子可顯著提高凡納濱對蝦血清中ACP、AKP 和LZM 活性，與前人研究結果相似，表明飼料中添加五倍子后，對蝦對病原體的消除作用增強，對蝦非特異性免疫能力提高。

CAT、SOD 屬于機體抗氧化酶，可清除機體內產生的有害物質O2-，從而避免細胞受其損傷[33]。水解單寧可有效提高副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 脅迫后的對蝦血清CAT 和SOD活性[34]。珍珠龍膽石斑魚的飼料中添加1 000～1 500 mg/kg 水解單寧顯著提高了肝臟中CAT 和SOD 活性[18]。飼料中添加水提五倍子可提高鳙血清SOD 活性[31]。水提五倍子活性成分主要由單寧組成，體外抗氧化實驗證明，水解單寧的抗氧化效果比同濃度的維生素C 和維生素E 更佳[35]，可提高水產動物的抗氧化能力。本研究中添加GC 可顯著提高凡納濱對蝦血清的CAT和SOD活性，與其在對蝦[34]、珍珠龍膽石斑魚[18]以及鳙[31]的研究一致，表明五倍子可提高凡納濱對蝦的抗氧化能力。

3.4 五倍子對對蝦全腸結構的影響

腸道在機體的營養代謝中有重要作用[36]。飼料成分是影響腸道組織形態的重要因素之一[18]，且消化道形態也會隨著營養水平和環境改變[37]，特別是腸道絨毛高度和肌層厚度。研究表明，水解單寧可顯著提高石斑魚腸道絨毛高度[18]。在陸生動物上有較多類似的結果，如肉雞[37]、仔豬[38-39]和羊[40]。本研究中，添加五倍子顯著提高了凡納濱對蝦腸道的絨毛高度和肌層厚度，與前人研究結果基本一致，究其原因可能是水解單寧酸進入腸道后會與腸上皮細胞的蛋白質結合，生成保護腸道黏膜的生物膜，并抑制病原體的入侵，降低腸道損傷發生概率，保護腸道結構同時促進腸道細胞增殖，使腸道絨毛長度和腸壁厚度顯著增加[39,41]。

4 結論

在本研究條件下，添加0.02%～0.04%五倍子顯著提高了凡納濱對蝦幼蝦的生長性能、抗氧化能力、非特異性免疫能力，改善了對蝦的腸道結構。