紅鰭笛鯛皮膚色素細胞組成、分布及類胡蘿卜素含量分析

許振民，陳子釗，崔海濤，王中鐸，郭昱嵩,2

（1.廣東海洋大學水產學院南海水產經濟動物增養殖重點實驗室/2.廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088）

體色是脊椎動物最具多態性的特征之一，是魚類適應性進化的重要表現。在消費市場上，魚類體色是魚身體健康的標志和評判魚質量的重要標準，多樣化的體色使得經濟魚類的觀賞價值更高。魚類皮膚顏色主要源自黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞及一些復合色素細胞[1,2]。斑馬魚（Danio rerio，藍色和銀色）、鱖（Siniperca chuatsi，棕黃色）和豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus，黑色或紅色）等魚類色素細胞類型相同，但體色模式不一樣[3-5]。色素細胞發育受KIT（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Kit）、集落刺激因子、白細胞酪氨酸激酶和內皮素等介導的多條信號通路調控，且神經和內分泌系統控制著體色的變化[6-11]。在物質組成上，皮膚顏色依賴于色素細胞內儲存的色素顆粒，紅/黃/橙色通常由蝶啶和類胡蘿卜素的積累所致，斑馬魚成魚黃橙色的依賴性物質是類胡蘿卜素[12-14]。

紅鰭笛鯛（Lutjanus erythropterus）隸屬鱸形目笛鯛科，廣泛分布于熱帶和亞熱帶的近岸和巖礁海區，是我國南海重要經濟魚類，其成魚體色呈紅色或粉紅色，背部顏色較深，腹部顏色較淡，體表擁有過眼條紋和尾部黑斑（https://fishbase.org）。鮮紅的體色是紅鰭笛鯛的重要形態和經濟特征。養殖魚由于缺乏膳食類胡蘿卜素來源，體色往往比野生魚暗淡，因此，通常在飼料中添加類胡蘿卜素以改善經濟魚體色。如，蝦青素、角黃素、葉黃素和螺旋藻等類胡蘿卜素著色劑可增加大黃魚（Larimichthys crocea）、金赤鯛（Pagrus auratus）、大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）和雜交黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的組織類胡蘿卜含量和皮膚色度[15-20]，但未見紅鰭笛鯛的有關報道。

本研究擬評估紅鰭笛鯛不同部位皮膚顏色，結合石蠟切片、冰凍切片和電鏡切片揭示紅鰭笛鯛色素細胞形態、組成和分布規律，研究類胡蘿卜素與紅皮膚的呈色關系，為揭示紅鰭笛鯛紅體色形成機制和進一步改善養殖魚體色提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用的紅鰭笛鯛為購自湛江市霞山水產品批發市場的養殖魚。體長（30.70±2.94）cm，體質量（680.82±168.45）g。

1.2 體色觀察

實驗魚經MS-222 麻醉，拭干體表水分，用相機（Canon EOS 550D）拍 照，并用色差儀（3nh NR60CP）測定皮膚體色值，樣本數為19尾。測定部位，背鰭前緣下方、側線鱗上方皮膚，腹鰭至臀鰭間皮膚，尾柄處皮膚。測定前進行色差儀白板校正，每個位置測定2 次，第2 次測量探頭旋轉180°，記錄體色值。

取相同大小的3 個部位皮膚，經磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，置于顯微鏡（Nikon ECLIPSE Ni-E）下觀察，隨機選取30 個視野統計色素細胞數量，計算平均單位面積下的黑色素細胞和紅色素細胞數量，用ImageJ v1.8進行統計分析。

1.3 組織學觀察

對1.2 的皮膚組織進行石蠟切片、冰凍切片和透射電鏡切片。石蠟切片用Bouin 氏固定液固定、HE 染色，切片厚度5 μm；冰凍切片組織置于-20 ℃恒溫下冰凍，經蔗糖脫水和OCT（Optimal cutting temperature）包埋等步驟制成冰凍切片，切片厚度4～6 μm；透射電鏡切片組織經固定、脫水、包埋和醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，使用電子顯微鏡（JEM-1400）觀察。

1.4 總類胡蘿卜素含量測定

總類胡蘿卜素含量（TCC）測定參考姚金明[20]方法進行。分別準確稱取皮膚、腸、肌肉、肝臟、視網膜和脾臟各0.1000 g，加入等質量無水硫酸鈉和1 mL 丙酮，勻漿，補充丙酮至容積為10 mL，于4 ℃下避光孵育3 d。以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，以丙酮為空白對照，在473 nm 下測定各組織提取液的光密度值。TCC質量分數（μg/g）計算：

式中，D為丙酮相在473 nm處的光密度值；K為常數（104）；V為提取液體積（mL）；E為摩爾消光系數，數值為2 500；G是樣品質量（g）。

1.5 液相色譜-質譜/質譜串聯法（LC-MS/MS）測定皮膚類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素含量參考Krinsky等[21]和Geyer等[22]的方法以液相色譜和質譜法測定。分別取1.2 中背部、腹部皮膚以及側線鱗下方（體側）皮膚，用研磨儀研磨（30 Hz，1 min）至粉末狀，稱取50 mg 研磨后粉末，用0.5 mL 含0.1 g/L 2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）的正己烷-丙酮-乙醇等體積混合液提取類胡蘿卜素，室溫下渦旋20 min，以4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清，重復提取1 次，離心，合并上清液，將得到的提取液濃縮，用100 μL 體積比1∶1 的甲醇/甲基叔丁基醚混合液復溶，過0.22 μm 濾膜后，保存于棕色進樣瓶，由邁特維爾生物科技有限公司（武漢）進行LC-MS/MS分析。

1.6 數據處理

利用SPSS 22.0 軟件通過單因素方差分析比較體色值和總類胡蘿卜素含量數據，顯著性水平設為0.05。

2 結果和分析

2.1 紅鰭笛鯛皮膚顏色差異

表1 顯示，腹部皮膚最亮（P＜0.05），背部皮膚最暗（偏黑）（P＜0.05），尾部皮膚最黃（P＜0.05），而尾部和腹部皮膚紅色值無顯著差異，且均顯著紅于背部皮膚。

表1 紅鰭笛鯛不同部位皮膚顏色值比較Table 1 Comparison of skin color values for different parts of Lutjanus erythropterus

不同部位皮膚的色素細胞數量結果（圖1）顯示，各部位皮膚紅色素細胞密度顯著高于黑色素細胞密度（P＜0.001），腹部皮膚中黑色素細胞數量稀少，甚至沒有。

圖1 紅鰭笛鯛不同部位皮膚黑色素細胞和紅色素細胞密度比較Fig.1 Comparison of chromatophore density in different parts of Lutjanus erythropterus

2.2 紅鰭笛鯛皮膚色素細胞的組織分布

形態學觀察結果顯示，背部皮膚和尾部皮膚均含有4 種色素細胞，即黑色素細胞和紅色素細胞交替分布，黃色素細胞和虹彩細胞位于下層；腹部皮膚主要包含紅色素細胞和虹彩細胞。組織學觀察結果顯示，皮膚由表皮和真皮組成，表皮由5～8 層細胞組成，表皮中層含有較多顆粒細胞，表皮下層有1～2 層杯狀細胞，而色素細胞緊密排列在真皮層，并形成兩條連續的色素帶，分別位于表皮與鱗片之間和真皮致密層頂部。背部和尾部皮膚中均可見黑色素細胞。冰凍切片顯示了黃色素細胞的分布，虹彩細胞從背部向腹部呈增加趨勢。透射電鏡結果顯示，背部皮膚中含有較多黑色素顆粒，與類胡蘿卜素油滴和反射小板相間分布，尾部皮膚中反射小板緊密分布于黑色素顆粒和類胡蘿卜素油滴下方，腹部皮膚中分布著大量反射小板（圖2）。

圖2 紅鰭笛鯛皮膚形態學和組織學觀察Fig.2 Morphological and histological characteristics in the skin of Lutjanus erythropterus

2.3 紅鰭笛鯛不同組織的類胡蘿卜素含量

圖3顯示，類胡蘿卜素在各組織中均有分布，但主要沉積在皮膚中，其次是視網膜。體側皮膚和背部皮膚中總類胡蘿卜素含量顯著高于其他部位皮膚（P ＜0.05）；尾部皮膚、腹部皮膚和視網膜中的含量顯著高于腸和肌肉（P ＜0.05）；腸、肝臟和脾臟中含量無顯著差異（P ＞0.05），肌肉中含量最低（P ＜0.05）（圖3）。

圖3 紅鰭笛鯛不同組織總類胡蘿卜素含量比較Fig.3 Comparison of total carotenoid contents in different tissues of Lutjanus erythropterus

液相色譜和質譜結果表明紅鰭笛鯛皮膚含68種類胡蘿卜素中的16 種，其中，背部皮膚含13 種，體側皮膚11 種，腹部皮膚7 種。皮膚中類胡蘿卜素主要以類胡蘿卜素酯的形式存在，其中葉黃素酯最為豐富，但未檢出游離的葉黃素單體。黃色類胡蘿卜素包括葉黃素酯、玉米黃質酯、紫黃質酯，β-隱黃質油酸酯和玉紅黃質棕櫚酸酯。紅色類胡蘿卜素包括蝦青素、角黃素和β-檸烏素，其中蝦青素和角黃素2 種紅色類胡蘿卜素均存在于3 個部位皮膚，并呈線性數量差異（圖4）。

圖4 紅鰭笛鯛不同部位皮膚類胡蘿卜素含量比較Fig.4 Comparison of carotenoid contents in different tissues of Lutjanus erythropterus

3 討論

3.1 色素細胞和體色的關系

魚類豐富多彩的體色是由色素細胞間相互作用所致，受到色素細胞種類、數量和排布方式的影響。色素細胞起源于神經嵴，并分布于皮膚真皮層，在鱖表皮中亦發現少量色素細胞。通過透射電鏡發現，斑馬魚的皮膚色素層依次為黃色素細胞、虹彩細胞和黑色素細胞，藍色條紋區域存在兩種排布方式的虹彩細胞[3]。鱖棕黃色皮膚的表層色素細胞為黃色素細胞，圖案區域含有大量連續分布的黑色素細胞[4]。豹紋鰓棘鱸皮膚中紅色素細胞和黑色素細胞均勻分布在真皮層，且紅色個體的紅色素細胞比黑色個體更多[5]。這說明表層色素細胞的分布特征對體色有重要的決定作用，皮膚圖案和呈色深淺受色素細胞數量的影響，即圖案區域和顏色較深的部位色素細胞數量越多，分布越密集。本研究中，紅鰭笛鯛皮膚的色素細胞分布在真皮層頂部，紅色素細胞和黑色素細胞交替分布在色素帶表層，紅色素細胞的數量優勢使得紅鰭笛鯛呈現紅體色，這與豹紋鰓棘鱸體色變異個體中色素細胞的分布特征較為相似。然而，紅色度與紅色素細胞數量無明顯關系，主要受黑色素細胞分布情況的影響。水產動物的體色與色素細胞發育、分化及調控有關，不同發育階段的體色模式存在差異。紅鰭笛鯛在胚胎發育過程中已分化出黑色素細胞，黃色素細胞見于2日齡的仔魚，最早在鰓蓋上發現了虹彩細胞，在魚鰭上看見紅色素細胞[23,24]。因此，紅體色分布存在階段性，色素的沉積主要依賴于色素細胞的生長與發育情況。

3.2 類胡蘿卜素含量與體色的關系

紅色、黃色和橙色通常由類胡蘿卜素積累所致。類胡蘿卜素是由植物、一些細菌和真菌合成的脂溶性化合物，魚類只能通過攝食獲得。目前已發現天然類胡蘿卜素1 000多種，根據顏色可分為紅色類胡蘿卜素和黃色類胡蘿卜素，這些類胡蘿卜素的含量差異影響著水生動物的呈色[12]。魚類總類胡蘿卜素含量存在組織差異。大西洋鮭（Salmo salar）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）等鮭科魚類的肌肉總類胡蘿卜素含量較高，而大黃魚主要沉積在皮膚中[19]。類胡蘿卜素對水生生物有調節生長、增強免疫力、抗氧化和改善視力等作用。葉黃素和玉米黃質主要積累在眼睛黃斑中，可減免藍光和近紫外光對視網膜的損害，玉米黃質可提高斑馬魚的視力[25]。葉黃素可改善日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）的生長性能和免疫活力[26]，提升金魚（Carassius auratus）幼魚的存活率以及改善黃顙魚的生長性能[17,27]。哺乳動物較易從食物中獲得類胡蘿卜素，而魚類會優先使用葉黃素，滿足其對維生素A 的需求。維生素A 有維持眼睛正常視覺、上皮組織正常生長與分化，調節免疫和骨骼發育的作用[28]。攝食類胡蘿卜素還可提升魚類皮膚的色澤。Yi 等[16]研究表明，大黃魚皮膚的類胡蘿卜素含量、黃色度和紅色度與飼料中葉黃素和角黃素的比例呈線性相關，角黃素含量越高越利于皮膚發紅。角黃素和蝦青素均有增加紅劍魚（Xiphophorus helleri）紅色的作用，而蝦青素的增色效果更明顯[15]。本研究中，類胡蘿卜素主要沉積在紅鰭笛鯛視網膜和皮膚組織中，葉黃素和玉米黃質等黃色類胡蘿卜素在皮膚中最為豐富，一方面可滿足皮膚組織細胞生長、免疫和抗氧化方面的需求，另一方面滿足了紅或黃色素細胞對黃色類胡蘿卜素的著色供應。黃色類胡蘿卜素主要沉積在背部和體側皮膚中，而腹部皮膚同樣分布著紅色素細胞，類胡蘿卜素類型卻不一致，這進一步說明紅色由紅色類胡蘿卜素提供。然而，蝦青素等紅色類胡蘿卜素所占比例極小。這可能意味著紅色呈色對紅色類胡蘿卜素的需求量不高，或是天然蝦青素多以蝦青素酯形式存在[29]。魚類除可將攝入的類胡蘿卜素直接用于體色呈色外，還可對攝入的類胡蘿卜素進行分子修飾并產生新的衍生物類型。例如，鯉科魚類可通過氧化修飾作用將玉米黃質轉化為蝦青素，但鮭魚不能通過代謝修飾合成蝦青素[30]。綜上，類胡蘿卜素是魚類呈色必不可少的物質，蝦青素和角黃素可改善紅色經濟魚類的體色，但紅色類胡蘿卜素在魚類體內的代謝調控機制尚不清楚。

4 結論

紅色素細胞的數量優勢及其在色素帶表層分布的特征是紅鰭笛鯛紅體色形成的重要原因。紅鰭笛鯛體內的類胡蘿卜素主要沉積在皮膚和視網膜中，蝦青素和角黃素2 種紅色類胡蘿卜素與紅體色密切相關。本研究結果為紅鰭笛鯛養殖魚體色的改善研究提供參考，可進一步在飼料中補充蝦青素和角黃素以提升紅色。