一鏈雙靶siRNA 對皮膚鱗狀細胞癌NET-1和Survivin 基因表達及增殖和凋亡的影響研究*

季周婧，張麗麗，張 捷

（南通大學附屬醫院皮膚科，江蘇 226001）

皮膚鱗狀細胞癌是一種常見的皮膚惡性腫瘤,發病率目前在世界范圍內呈上升趨勢[1],其發病機理、預防和治療是研究熱點[2]。siRNA（small interfering RNA）是一種短片段雙鏈RNA 分子,能以同源互補序列的mRNA 為靶目標降解特定mRNA,導致相應基因沉默。NET-1 屬于四聚體超家族（tetraspanin superfamily）（TM4SF）成員之一,其表達與多種腫瘤的過度增殖有關[3-4]。本課題組前期研究發現,靶向NET-1 的siRNA 真核表達載體能有效下調NET-1 基因表達,抑制A431 皮膚鱗癌細胞的增殖、遷移和浸潤,提示NET-1 可能在A431 細胞增殖、遷移、侵襲過程的信號傳遞中起關鍵作用[5-6]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成員,是近年來新發現的凋亡抑制基因[7]。本課題組前期研究顯示,在皮膚鱗癌形成和發展中促增殖基因NET-1 和抗凋亡基因Survivin 起重要作用,抑制此兩種基因可起到協同抗腫瘤作用。本研究構建一組同時靶向NET-1和Survivin 基因的一鏈雙靶siRNA,通過脂質體介導轉染A431 細胞,研究一鏈雙靶siRNA 對皮膚鱗癌細胞株NET-1 和Survivin 基因的抑制作用以及對細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人皮膚鱗癌細胞株A431 由西安第四軍醫大學西京醫院全軍皮膚病研究所高天文教授惠贈。

1.2 構建一鏈雙靶siRNA 在已經篩選確定的單靶siRNA 序列基礎上,根據siRNA 優化原理,將NET-1 基因siRNA 靶點序列和Survivin 基因siRNA靶點序列進行排列組合,設計一條一鏈雙靶siRNA序列,其中正義鏈為連續的長鏈RNA,反義鏈為不連續的2 條短鏈RNA。NET-1 和Survivin siRNA 由百奧邁科生物技術有限公司協助設計與合成。經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,合成的siRNA 質量佳。siRNA 序列見表1。

表1 siRNA 序列

1.3 細胞培養及轉染 將A431 細胞接種于DMEM培養液（美國Invitrogen 公司）中,內含10%小牛血清（FCS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素,置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。待細胞貼壁后更換細胞培養液,細胞長滿培養瓶90%以上進行傳代。轉染前1 d 將對數生長期A431 細胞以2×105個/mL密度接種于6 孔板（Nunc 公司）,待細胞生長匯合達到70%時,參照Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司）操作說明以50 nmol/L 終濃度加入細胞中進行轉染。共分為5 組：第一組轉染一鏈雙靶siRNA,第二組轉染NET-1 siRNA,第三組轉染Survivin siRNA,第四組轉染NC siRNA,第五組為未轉染組（空白對照組）。于37 ℃、5%CO2細胞培養箱內培養48 h,熒光顯微鏡（Olympus BXn）檢測細胞轉染效率。

1.4 細胞免疫共沉淀 將對數生長期A431 細胞以2×105個/mL 密度接種于6 孔板,細胞匯合度達到90%時加入RIPA 細胞裂解液（含PMSF 蛋白酶抑制劑）,冰上裂解30 min,12 000 r/min 離心30 min 后取上清。取少量上清液用于檢測蛋白表達,其余上清液分成兩管,一管加入1 μg NET-1 抗體和30 μL protein A -beads,另一管不加抗體作為對照,4 °C 緩慢搖晃孵育過夜。免疫沉淀反應后,4°C 下3 000 r/min離心15 min,將protein A -beads 離心至管底;小心吸去上清,protein A-beads 用裂解緩沖液洗3 次;加入15 μL 2×SDS 加樣緩沖液,沸水煮10 min。采用Western blot 法檢測蛋白表達,蛋白經電泳、轉膜、封閉后,加入鼠抗人Survivin 抗體（1∶200）一抗4 ℃孵育過夜,洗去一抗后,加入兔抗鼠IgG 抗體（1∶2 000）二抗室溫孵育2 h,ECL 化學發光顯影。反向免疫共沉淀操作同上,用Survivin 抗體代替上面的NET-1抗體,Western blot 法檢測蛋白表達時以NET-1 抗體為一抗,羊抗兔IgG 抗體為二抗。

1.5 qRT-PCR 檢測基因表達 細胞轉染48 h 后收獲細胞,TRIzol 法提取各組細胞總RNA,以mRNA為模板,oligo dT 為引物,逆轉錄合成cDNA。逆轉錄反應條件為42 ℃30 min,Real-time PCR 反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,green I 0.5 μL,P1（10 μmol/L）0.5 μL,P2（10 μmol/L）0.5 μL,模板4 μL,DEPC 水7 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性20 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40 個循環。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR 引物序列

1.6 Western blot 法檢測細胞蛋白表達 細胞轉染48 h 后加入細胞裂解液,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心15 min,取上清,BCA 法檢測細胞總蛋白濃度。將40 μg 蛋白質與相應體積的2×上樣緩沖液混合,煮沸5 min 后上樣,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后采用半干轉印儀（Bio-Rad公司）將蛋白從凝膠中轉移至PVDF 膜（美國Pharmacia 公司）,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入兔抗人NET-1 抗體（1∶200）和鼠抗人Survivin 抗體（1∶200）,4 ℃孵育過夜。洗去一抗后,加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體（1∶1 000）和兔抗鼠IgG抗體（1∶2 000）室溫孵育2 h。ECL 化學發光顯影,以β-actin 作為內參。

1.7 CCK-8 法檢測細胞增殖活力 取對數生長期A431 細胞,0.25%胰蛋白酶消化后,調整細胞濃度為1×104個/孔接種于96 孔培養板中。分為5 組,設3個時間點（24 h、48 h、72 h）,每個時間點作3 個復孔。每孔加入100 μL 培養液,37 ℃、5%CO2下培養,次日進行瞬時轉染,于轉染后24 h、48 h、72 h 進行CCK-8 檢測。將10 μL CCK-8 和100 μL DMEM 培養液（不含小牛血清）混合后加入各孔,放入培養箱培養2 h,酶標儀測定各孔吸光值。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉染48 h 后細胞,制備單細胞懸液,調整細胞濃度約1×106個/mL,取1 mL 細胞懸液用0.01 mol/L PBS 洗滌2 次,2 000 r/min 離心5 min,棄上清。將細胞重懸于500 μL Binding Buffer 中,先后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,室溫避光反應5 min,立即上流式細胞儀（FACSCallibur,美國BD 公司）檢測。

1.9 細胞免疫熒光檢測NET-1、Survivin 蛋白在細胞內的表達 取對數生長期細胞以1×105個/mL 密度接種于鋪有載玻片的6 孔板,待細胞生長匯合達到70%時,同前分組進行轉染。轉染后48 h 以4%中性甲醛于4 ℃下固定細胞2 h,1%Trition 破膜30 min,1%BSA 室溫封閉2 h,加一抗（1∶50）4 ℃過夜。PBS洗3 遍后加入TRITC 和FITC 標記的熒光二抗（1∶200）,避光室溫孵育2 h,Hochest（1∶1 000）避光染色30 min,緩沖甘油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照,用于TRITC 激發波長為550 nm,FITC 激發波長為495 nm,Hochest 激發波長為353.6 nm,計數各組表達NET-1和Survivin 陽性細胞。

1.10 統計學處理 應用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）,多組間比較采用方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞免疫共沉淀證實NET-1 和Survivin 在A431 細胞中的相互作用 用鼠抗人Survivin 抗體和A431 細胞總蛋白進行免疫共沉淀,免疫復合物電泳轉膜后用兔抗人NET-1 抗體進行免疫印跡分析。結果表明,Western blot 檢測到免疫復合物中含NET-1 蛋白,證明NET-1 和Survivin 存在相互作用,免疫印跡中出現的條帶與細胞總蛋白條帶一致（圖1a）,反向免疫共沉淀Western blot 也同樣檢測到免疫復合物中含Survivin 蛋白（圖1b）,證實A431細胞中NET-1 和Survivin 存在相互作用。

圖1 A431 細胞中NET-1 和Survivin 蛋白表達

2.2 單靶和一鏈雙靶siRNA 轉染后A431 細胞中NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白的表達 A431 細胞轉染各組siRNA 48 h 后,熒光顯微鏡檢測細胞轉染效率達到80%。與siRNA-NC 組和control 組比較,轉染NET-1 siRNA 組細胞中NET-1 mRNA 水平降低57%,蛋白水平降低54%（圖2,圖3）,表明靶向NET-1 的siRNA 能有效下調NET-1 基因表達。同樣,與control 組比較,轉染Survivin siRNA 組細胞中Survivin mRNA 水平降低52%,蛋白水平降低58%（圖2,圖3）。有趣的是,我們發現轉染NET-1 siRNA 組細胞中Survivin mRNA 水平降低11%（圖2）,蛋白水平降低27%（圖3）,轉染Survivin siRNA組細胞中NET-1 mRNA 水平降低19%（圖2）,蛋白水平降低15%（圖3）,表明干擾NET-1 的信號通路會降低Survivin 表達,同樣干擾Survivin 信號通路會降低NET-1 表達。與control 組比較,轉染一鏈雙靶siRNA 組細胞中NET-1 mRNA 和蛋白水平分別降低80%（圖2）和85%（圖3）,Survivin mRNA 和蛋白水平分別降低77%（圖2）和82%（圖3）。一鏈雙靶siRNA 組mRNA 和蛋白表達水平明顯低于各單靶siRNA 組,差異均有統計學意義（P＜0.05）,表明一鏈雙靶siRNA 組基因沉默效果明顯優于單靶siRNA組。siRNA-NC 組與control 組細胞中NET-1 和Survivin mRNA 及蛋白表達比較,差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 轉染siRNA 后各組細胞NET-1和Survivin mRNA 相對表達量

圖3 轉染siRNA 后各組細胞中NET-1 和Survivin 蛋白表達

2.3 轉染siRNA 后各組A431 細胞增殖水平 轉染24 h、48 h、72 h 時一鏈雙靶和單靶siRNA 組細胞增殖水平較siRNA-NC 組和control 組降低,差異均有統計學意義（P＜0.05）。一鏈雙靶siRNA 組細胞增殖水平低于siRNA-NET-1 組和siRNA-Survivin 組,差異均有統計學意義（P＜0.05）。單靶siRNA-NET-1 組和siRNA-Survivin 組細胞增殖水平比較,siRNA-NC組與control 組細胞增殖水平比較,差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8 法檢測A431 細胞轉染siRNA 后細胞增殖曲線

2.4 轉染siRNA 后各組A431 細胞凋亡水平 經Annexin V 和PI 雙染色流式細胞儀檢測獲得由4 個象限組成的細胞散點圖,其中左下象限代表活細胞,左上象限代表機械損傷細胞,右下象限代表凋亡細胞,右上象限代表晚期凋亡和死亡細胞。與siRNANC 組和control 組比較,轉染NET-1 siRNA 組、Survivin siRNA 組和一鏈雙靶siRNA 組細胞凋亡水平均明顯升高,差異均有統計學意義（P＜0.05）。一鏈雙靶siRNA 組凋亡率高于NET-1 siRNA 組和Survivin siRNA 組,差異均有統計學意義（P＜0.05）。siRNANC 組與control 組細胞凋亡率比較,差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 流式細胞術檢測A431 細胞轉染siRNA 后細胞凋亡

2.5 細胞免疫熒光檢測NET-1 和Survivin 蛋白在細胞內的表達 細胞免疫熒光顯示,NET-1 和Survivin 蛋白表達在細胞質和（或）細胞膜中（圖6A）。轉染siRNA-NET-1&Survivin、siRNA-NET-1、siRNASurvivin 48 h 后,NET-1 和Survivin 蛋白陽性細胞百分率較control 組降低,差異均有統計學意義（P＜0.05）。一鏈雙靶siRNA 組NET-1 和Survivin 蛋白陽性細胞百分率明顯低于siRNA-NET-1 和siRNASurvivin 組,差異均有統計學意義（P＜0.05）。siRNANC 組NET-1 和Survivin 蛋白陽性細胞百分率與control 組比較,差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖6B。

圖6 A431 細胞轉染siRNA 各組NET-1 和Survivin 蛋白定位與表達

3 討 論

NET-1 基因是新近報道的腫瘤相關基因,已發現NET-1 與腫瘤細胞增殖、黏附、遷移、浸潤和誘導血管形成密切相關[8-10],并對判斷預后有一定價值。本課題組前期研究發現靶向NET-1 的siRNA 抑制A431 細胞增殖、遷移和浸潤[11]。Survivin 是迄今發現的最強凋亡抑制因子[7],可能通過抑制正常細胞凋亡信號傳導通路,使受損細胞逃避免疫系統的監視而無法清除,從而異常存活、形成優勢克隆而參與腫瘤的發生發展。

RNA 干擾技術在腫瘤基因治療中具有巨大潛力,然而單基因治療的效果不甚理想,向腫瘤細胞內導入多種相關基因發揮相互協同作用,以提高抗腫瘤效果是基因治療的發展方向。有證據表明,為了最大限度發揮shRNA 干擾效率,CHEN 等[12]構建同時針對VEGF、hTERT 和Bcl-xl 三種基因的shRNA,然后直接注射到異種移植Hep-2 腫瘤裸鼠體內,結果發現VEGF、hTERT 及Bcl-xl mRNA 和蛋白表達顯著降低,腫瘤生長曲線顯示其腫瘤治療效果明顯優于對照組和非轉染組。

本研究在已篩選確定的單靶NET-1 siRNA 和Survivin siRNA 序列的基礎上,構建了針對NET-1和Survivin 基因的一鏈雙靶siRNA。在轉染一鏈雙靶siRNA 和單靶siRNA 的同時,以siRNA-NC 作為空載體對照組,排除載體轉染對細胞活力的影響,以未轉染作為空白對照組,排除試劑對細胞活力的影響。qRT-PCR、Western Blot 和細胞免疫熒光檢測表明,一鏈雙靶siRNA 能顯著抑制NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白表達,抑制效果明顯優于單靶siRNA,提示一鏈雙靶siRNA 能同時關閉兩個靶基因,從而更有效下調NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白表達。CCK-8 法和流式細胞術顯示,轉染一鏈雙靶siRNA后細胞凋亡率明顯升高,細胞增殖顯著受到抑制,效果優于單靶組,差異均具有統計學意義（P＜0.05）。免疫共沉淀證實NET-1 和Survivin 存在相互作用,提示NET-1 和Survivin 可聯合作為皮膚鱗癌的診斷指標和治療靶標。