博落回生物堿與茶皂素對2 種茶葉病原菌的聯(lián)合毒力測定

梁浩，杜曉靜,錢璽丞，賈長青，郁建生

（銅仁職業(yè)技術學院國家民委中獸藥重點開放實驗室，貴州 銅仁 554300）

茶樹是我國南方地區(qū)重要的經(jīng)濟作物之一[1]，因其口感獨特和保健作用，深受廣大消費者青睞。由于茶農(nóng)依賴化學農(nóng)藥防治茶樹病蟲害，極易造成農(nóng)藥殘留超標。農(nóng)藥殘留已成為我國茶葉出口歐盟的技術性壁壘[2]，尋找高效低殘留無公害農(nóng)藥防治茶樹病蟲害至關重要。

茶輪斑病和炭疽病是貴州茶區(qū)發(fā)病范圍較廣的重要病害，因缺乏安全有效的防控措施，嚴重影響著茶樹生長和翌年春茶產(chǎn)量[3-4]。目前防治這兩種病害的生物農(nóng)藥較少，主要通過化學藥劑防治。化學農(nóng)藥長期使用不僅污染環(huán)境，還會產(chǎn)生抗性問題。為確保茶葉的品質和安全，篩選出高效安全低毒的農(nóng)藥迫在眉睫[5-6]。

近年來，植物源農(nóng)藥因其低毒、低殘留和多靶標等特點成為研究熱點。作為一種低成本高效的植物源農(nóng)藥，博落回生物堿在防治多種農(nóng)作物病蟲害方面表現(xiàn)出了良好的殺蟲和抑菌活性[7]。茶皂素作為一種植物源農(nóng)藥，雖然自身抑菌活性不高，但研究表明其對多種農(nóng)藥都表現(xiàn)出了較好的增效作用，通過與其他農(nóng)藥復配，可大大減少農(nóng)藥的用量[8-10]。

據(jù)此，本研究測定了博落回生物堿和茶皂素2種單劑及其不同比例的混和劑對茶輪斑病菌和茶炭疽病菌的室內毒力以及增效作用，旨在為茶皂素和博落回生物堿對這兩種病害的田間防治提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

茶輪斑病和茶炭疽病均分離于正大現(xiàn)代高效茶葉示范園區(qū)，經(jīng)上海生工生物工程技術服務有限公司鑒定。

1.2 主要材料與試劑

博落回生物堿（純度為76%），參照文獻[11]自制；茶皂素（65%；上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖、瓊脂粉等其他試劑為市售分析純試劑。

1.3 主要儀器與設備

超聲波清洗機（KQ800E，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（T10CS，北京普析通用儀器有限責任公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化工作臺設備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YM50，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；恒溫恒濕箱（HWS450B，杭州綠博儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 室內離體活性測試 用無菌水將2 種藥劑配置成100 μg·mL-1的溶液。采用菌落直徑法。在含藥PDA 培養(yǎng)基平板中央分別接供試菌種的新鮮菌絲塊菌碟，菌絲朝下（每個處理設3 個重復）。將含藥接菌的培養(yǎng)皿放置于25 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，定期觀察，采用十字交叉法測菌落直徑，計算抑菌率。

1.4.2 博落回生物堿與茶皂素對兩種病原菌的EC50值 測定博落回生物堿與茶皂素對2 種植物病原菌的EC50值時，采用菌落直徑法，設置5 個濃度梯度，計算各個濃度下對2 種植物病原菌的抑制率，通過計算，得出測定博落回生物堿與茶皂素對2 種植物病原菌的EC50值。

1.4.3 博落回生物堿與茶皂素最佳配比篩選 采用Horsfal 方法[12-13]進行混配比例設計，以博落回生物堿與茶皂素2 種單劑的的EC50為基礎濃度，將2 種藥劑EC50藥液按照體積比和空白對照共設置12 個處理進行測定（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100、0∶0），見表1。每處理3 個重復，采用十字交叉法參照1.4.1 計算各配比抑制率，再根據(jù)以下公式計算毒性比率（毒性比率＞1.25 為增效；毒性比率＜0.75 為拮抗；0.75≤毒性比率≤1.25 為相加）。在此基礎上，初步篩選出最佳配比。

表1 各處理博落回生物堿與茶皂素EC50 值劑量百分比

1.4.4 最佳配比聯(lián)合毒力測定 采用Wadley 法[14]定量篩選，根據(jù)初步篩選出的最佳配比（1.4.3 試驗結果），將有增效作用的體積配比進行混合測定聯(lián)合毒力并計算混劑的增效系數(shù)SR（SR＞1.5 為增效，0.5≤SR≤1.5 為相加，SR＜0.5 為拮抗），評價復配劑增效比。

式中，EC50(ob)(A)、EC50(ob)(B)分別代表混劑中博落回生物堿和茶皂素的EC50實測值；EC50(ob)（實測值）、EC50(th)（理論值）；a（博落回生物堿的百分含量%）、b（茶皂素在混劑中的百分含量%）；SR 代表增效系數(shù)。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 采用orgin 9.1 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算各處理平均菌落直徑和平均抑制率；采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對藥劑濃度對數(shù)值及對應的菌絲生長抑制率幾率值進行回歸分析，求出各單劑及其不同配比混劑的毒力回歸方程、相關系數(shù)r 和EC50值。

2 結果與分析

2.1 室內離體活性測試

抑菌活性測定結果表明（表2），博落回生物堿對茶輪斑病和茶炭疽病均表現(xiàn)出了較好的抑菌活性，其中，對茶輪斑病的抑菌活性高于同濃度的多菌靈和吡唑醚菌酯。

表2 博落回生物堿與茶皂素對2 種病原菌離體活性測試100（μg·mL-1）

2.2 博落回生物堿與茶皂素對2 種病原菌的EC50 值

由表3 可知，博落回生物堿對2 種茶樹病原菌均有較好的抑菌活性，EC50值分別為6.219、51.674 μg·mL-1；茶皂素對2 種病原菌的抑菌活性較差，EC50值分別為416.435、453.925 μg·mL-1。

表3 博落回生物堿與茶皂素對2 種植物病原菌EC50 值

2.3 博落回生物堿與茶皂素最佳配比篩選

以單劑博落回生物堿與茶皂素的近似EC50值為基礎，采用采用交互測定法進行最佳配比的篩選。試驗結果表明（表4），在所選配比中，博落回生物堿與茶皂素EC50體積比90∶10、80∶20、60∶40、50∶50、30∶70、20∶80、10∶90 對茶輪斑病菌的毒性比率分別為1.07、1.08、1.15、1.15、1.13、1.17、1.11，表現(xiàn)為相加作用，當博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為70∶30、40∶60 時，對茶輪斑病菌的毒性比率分別為1.32、1.41，表現(xiàn)為增效作用；當博落回生物堿與茶皂素EC50體積比90∶10、80∶20、10∶90 對茶炭疽病菌的毒性比率分別為0.98、1.20、1.21，表現(xiàn)為相加作用，當博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比為70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80 時，對茶炭疽菌的毒性比率分別為1.29、1.39、1.52、1.64、1.70、1.67，表現(xiàn)為增效作用。綜合以上結果，對茶輪斑病菌分別取博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比70:30、40:60，對茶炭疽菌分別取博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80 作聯(lián)合毒力驗證。

表4 博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑對2 種病原菌的毒性比率

2.4 最佳配比聯(lián)合毒力測定

結合2 個單劑的EC50值，根據(jù)Wadley 法計算博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑理論上的EC50(th)，并與實際觀察的EC50(ob)比較，計算增效系數(shù)(SR)。由表5 可知，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例40∶60 配比混劑對茶輪斑病菌的增效系數(shù)為1.095，均介于0.5～1.5 之間，表現(xiàn)為相加作用，比例40∶60 配比混劑對茶輪斑病菌的增效系數(shù)為1.545，大于1.5，表現(xiàn)為增效作用。博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例30∶70、20∶80 配比混劑對茶炭疽病菌的增效系數(shù)為1.181、0.616，均介于0.5～1.5 之間，表現(xiàn)為相加作用，比例70∶30、60∶40、50∶50、40∶60 配比混劑對茶炭疽病菌的增效系數(shù)為2.698、2.345、2.974、1.533，均大于1.5，表現(xiàn)為增效作用。

表5 博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑對2 種病原菌的聯(lián)合毒力

3 討論與結論

研究表明，農(nóng)藥合理混配不但可以延緩藥劑抗性的發(fā)生和發(fā)展，亦可擴大防治譜，提高防效，降低單位面積內的用藥, 將不同作用機理的殺菌劑復配表現(xiàn)出優(yōu)于單劑的防治效果，極大地促進了復配殺菌劑的快速發(fā)展[15-16]。目前博落回生物堿對茶樹病害活性研究方面主要集中在對茶樹蟲害的防治，對茶樹病害的防治較少[17-19]。茶皂素對茶輪斑病、茶白星病和茶炭疽病均有一定的防治效果[20]，最近國內外不少學者報道了茶皂素對農(nóng)藥的增效作用[21]，茶皂素與山蒼籽油、代森錳鋅和多菌靈復配，對茶葉炭疽病和輪斑病顯示出明顯的增效作用[22-23]。

本試驗研究了博落回生物堿與茶皂素單劑和復配對茶輪斑病菌和茶炭疽病菌的抑菌活性，結果表明博落回生物堿對茶樹輪斑病和茶樹炭疽病的EC50分別為6.219、51.674 μg·mL-1；茶皂素對茶樹輪斑病和茶樹炭疽病的EC50分別為416.435、453.925 μg·mL-1；通過毒性比率篩選和聯(lián)合毒力測定，確定了博落回生物堿與茶皂素對2 種病原菌的最佳抑菌配比。針對茶輪斑病菌，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為70∶30（質量比為1∶28.7）的增效系數(shù)最大，可作為最佳配比；針對茶炭疽病菌，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為50∶50（質量比為1∶8.8）的增效系數(shù)同樣最大，但該配比混劑中博落回生物堿的實際含量明顯高于70∶30、60∶40 配比；從降低農(nóng)藥使用成本等方面考慮，茶皂素價格遠低于博落回生物堿，因此選擇博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比例為70∶30（質量比為1∶3.8）進行混配較為合理[12]。本試驗可以為茶葉炭疽病和茶葉輪斑病綠色防治提供科學的參考。最近國內外報道了茶皂素作為一種非離子型表面活性劑，可進一步增強農(nóng)藥在生物體表面粘著力和劑在靶體表面的持留能力，從而提高農(nóng)藥對病害的田間防治效果[10]。但是關于博落回生物堿和茶皂素在茶園的田間協(xié)同防治效果還亟需進一步開展田間防效研究，還需結合對非靶標生物的安全性及其對茶園天敵昆蟲等有益生物的影響，這將對茶園科學防控和綠色防控具有重要的指導意義。