不同類型及不同品種百合的雜交親和性與胚挽救

周 敏, 趙秋燕, 張 迪, 魏春梅, 陶宇蝶, 黃美娟, 黃海泉

(西南林業大學園林園藝學院/國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心/云南省功能性花卉資源及產業化技術工程研究中心/西南林業大學園林園藝花卉研發中心,云南昆明 650224)

百合(Liliumsp.)是百合屬植物的統稱,因其花姿優美、寓意美好而受到眾多消費者喜歡。目前市場上主要的百合栽培品種是亞洲百合雜種系(Asiatic hybrids)、東方百合雜種系(Oriental hybrids)、麝香百合雜種系(Longiflorumhybrids)及OT (Oriental×Trumpet hybrids)、LA(Longiflorum×Asiatic)、OA (Oriental×Asiatic )雜交種[1]。亞洲百合開花早、花色豐富、種球小且耐貯藏,但不耐高溫,易感灰霉病[2];東方百合及OT百合花朵碩大且芳香,生長周期長,具有抗灰霉病的特性[3],但其花色不夠豐富;麝香百合花型獨特,花香清新,但是花色單一,抗病毒病的能力較差[4];LA百合綜合了亞洲百合、麝香百合的特性,其花色豐富,但大多數無香。因此,為了培育綜合性狀優良的百合新種質,本研究以花色豐富、花大芳香、抗性作為育種目標進行百合的近緣、遠緣雜交育種,探索不同百合品種間交配的親和性規律,以期培育出具有自主知識產權的百合新品種。

雜交育種是獲得百合新品種最主要的途徑,但是百合雜交常表現出種間不親和性,致使雜交失敗。雜交不親和主要包括受精前障礙、受精后障礙,其中受精前障礙主要是由于花柱的長度不同或是柱頭上部和下部出現抑制作用,導致無法受精。羅建讓研究發現,延遲多次授粉和蕾期多次授粉對克服百合自交障礙的效果較好,離體和切割柱頭授粉對克服百合雜交過程的受精前障礙較為有效[5]。受精后障礙主要是由胚胎、胚乳及母體組織間遺傳物質的不平衡引起的[6]。近年來,研究者對克服受精后障礙做了大量研究,如劉玉采用胚培養的方法成功獲得了亞洲百合與LA的雜交苗[7]。馬冰研究發現,用授粉第40～50天卷丹百合與亞洲百合雜交的幼胚進行整個種子培養的萌發率較高[8]。目前已有關于百合雜交親和性[9-13]、百合雜交障礙克服[14-15]的相關報道,但是百合的遺傳背景復雜,影響其雜交成功的因素諸多,需要進一步探究其內在機制。

我國是世界百合的起源中心,也是全世界百合屬植物的主產地之一[16],但是我國百合育種工作起步較晚,國內通過常規育種的百合新品種非常有限,在生產上大面積推廣應用的仍以國外品種為主,自主品種微乎其微,對我國百合生產的規模和效益造成了一定影響。因此,本研究用22個百合品種進行雜交,通過常規授粉和胚挽救技術,探討雜交親和性并解決受精障礙,以期為創制百合新種質奠定理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料購自云南滇峰花卉有限公司,于2021年4月栽種于西南林業大學樹木園試驗大棚內。(1)東方百合雜種系:索邦,花為粉色;所羅門之王,花為玫紅色且有白色花邊;陽光冰島,花為黃色;馬提尼克,花為粉色且有白色花邊;西伯利亞,花為白色;八點后,花為粉色且有白色花邊。(2)OT百合雜種系:紫色大理石,花為紫色;羅賓娜,花為玫紅色;桌舞,花為淡粉色;閃點,花為白色且中心有玫紅色斑紋;帕拉佐,花為黃色。(3)亞洲百合雜種系:小珍珠,花為粉色;小月亮,花為淺橙色;小火箭,花為紅色;小圖標,花為淡粉色。(4)麝香百合雜種系:白色海洋,花為白色;卡里,花為白色且中心有粉色斑紋。(5)LA雜種系:帝王黃,花為黃色;眼線,花為白色且有黑色線形花邊;甜蜜贊比亞,花為白粉色且具斑紋;穿梭,花為橙色;愛馬仕,花中心呈黃色,邊緣為紅色。均采用種植袋(45 cm×50 cm)進行種植,每袋放置10個種球。

1.2 試驗方法

1.2.1 去雄及花粉生活力的測定 為了避免花朵開放后混入其他花粉,在花朵開放前1～2 d進行去雄套袋,同時為了防止組合間花期不遇,收集花藥后帶回實驗室,置于室溫下讓其開裂,于4 ℃保存花粉。花粉在授粉前均采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法進行生活力的測定。

1.2.2 雜交授粉 采用常規的授粉方法進行雜交:待母本柱頭分泌大量黏液時,將父本花粉涂抹于母本柱頭上,并于授粉當天重復授粉2次,每個雜交組合授粉10朵,授粉后掛牌并標明母本、授粉日期。授粉后第7天開始觀察并記錄子房發育情況,第30天統計子房膨大數,計算膨大率,授粉后第60～75天采用油標卡尺測量蒴果大小,并計算干種子有胚率。子房膨大率=膨大子房數/授粉花朵數×100%;有胚率=有胚種子數/種子數×100%。

1.2.3 胚挽救技術 在筆者所在課題組前期研究的基礎上,經過不斷優化,篩選出的培養基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂,pH值為5.8～6.0。采用2種胚挽救技術:采收雜交后第7～30天停止發育的子房,進行消毒處理后用刀片將其切成2 mm的薄片進行子房切片培養(25 ℃暗培養60 d后取愈傷組織進行重新轉接,進行光培養,培養基成分不變);采收授粉后60～75 d的子房進行幼胚培養(培養條件:光—暗周期為16 h—8 h,溫度為20～25 ℃),60 d后觀察蒴果成活率和生長狀況。

1.3 數據處理

用SPSS 23.0對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 花粉生活力的測定

從表1可知,在不同百合品種之間,新鮮花粉生活力差異顯著,其中東方百合所羅門之王的花粉生活力最高,是同雜種系索邦的1.7倍;OT百合紫色大理石的花粉生活力最高,是同雜種系閃點的1.61倍;亞洲百合小火箭的花粉生活力最高,是同雜種系小月亮的1.5倍;LA百合穿梭的花粉生活力最高,是同雜種系眼線的1.15倍。

表1 百合不同品種的花粉生活力

由圖1可以看出,平均花粉生活力表現為麝香百合>東方百合>LA百合>亞洲百合>OT百合,說明在雜交育種中,麝香百合、LA百合和東方百合的花粉生活力較高,可以作為良好的父本材料,OT與亞洲百合則可作為母本材料。

2.2 百合同雜種系內不同品種雜交親和性的比較與分析

如表2所示,不同百合品種之間系內正反交其雜交結實情況均存在一定差異。OO雜種系系內正反交除馬提尼克×八點后雜交組合未獲得有胚種子外,其他組合均不同程度地獲得了膨大子房及有胚種子,在索邦×所羅門之王組合中,其正交組合的子房膨大率、蒴果大小分別是反交組合的2.73、1.14倍,反交組合的有胚率是正交組合的1.45倍。在索邦×西伯利亞組合中,其反交組合的子房膨大率是正交組合的1.11倍,蒴果大小、 有胚率分別是反交的1.13、2.82倍。將OT雜種系桌舞和羅賓娜進行系內正反交,發現其正交組合的子房膨大率、蒴果大小分別是反交組合的3.44、1.71倍, 但是正交組合并未獲得有胚種子,反交組合的有胚率為38.48%。對AA雜種系小月亮×小珍珠而言,僅正交組合獲得了有胚種子,其反交組合的子房膨大率是正交的2.22倍,且反交組合的蒴果比正交組合小7.5%。在LA雜種系甜蜜贊比亞和眼線系內的正反交組合中,僅正交組合獲得了膨大子房,子房膨大率為57.14%,有胚率均為0,說明雜交的親和性較差,存在嚴重的受精后障礙。綜上可知,同雜種系內不同品種的雜交親和性各不相同,其中OO雜種的系內親和性較好,LA雜種的系內親和性較差。

表2 不同品種間的系內雜交情況

2.3 百合不同雜種系間雜交親和性的比較與分析

如表3所示,不同雜種系間雜交后,其雜交結實情況差異明顯。以東方百合雜種系為母本與亞洲百合、OT系列和LA系列進行雜交育種,發現其子房膨大率、蒴果大小及有胚率均存在一定差異。其中在東方百合雜種系與亞洲百合雜種系的雜交組合中, 索邦×小圖標的子房膨大率、蒴果大小分別是馬提尼克×小月亮的2.00、1.21倍,但是有胚率比馬提尼克×小月亮低92.08%。在東方百合雜種系與麝香百合雜種系的雜交組合中,馬提尼克與麝香百合白色海洋、卡里的子房膨大率均為0,未獲得有胚種子,說明東方百合與麝香百合之間雜交不親和,存在受精障礙。在東方百合雜種系與OT系列的雜交組合中,所羅門之王×激情月球的子房膨大率、蒴果大小分別是馬提尼克×閃點的2.00、1.58倍,僅所羅門之王×激情月球獲得有胚種子,有胚率為42.42%。以OT雜種系為母本,與LA、麝香百合、亞洲百合、東方和OT雜種系進行雜交育種,發現其子房膨大率、蒴果大小及有胚率均存在一定差異。在OT系列與LA系列的雜交組合中,紫色大理石×穿梭的子房膨大率是紫色大理石×愛馬仕的1.49倍,但有胚率比紫色大理石×愛馬仕低90.71%。在OT系列與東方百合雜種系的雜交組合中,羅賓娜×索邦的子房膨大率是羅賓娜×所羅門之王的3.00倍,蒴果比羅賓娜×所羅門之王小8.97%,僅羅賓娜×索邦獲得有胚種子,有胚率為12.12%。在OT系列與亞洲百合雜種系的雜交組合中,紫色大理石×小火箭的子房膨大率是帕拉佐×小月亮的2.22倍,蒴果比帕拉佐×小月亮小50.94%。索邦×小圖標、紫色大理石×穿梭、激情月球×卡里和紫色大理石×小火箭等不同雜交組合雖然都獲得了較高的子房膨大率和蒴果長寬比,但是有胚種子的獲得率較低,說明其可能是胚發育不完全或受花粉刺激出現的假膨大[17]。馬提尼克×閃點、羅賓娜×所羅門之王和帕拉佐×小月亮的有胚率為0,說明存在嚴重的受精后障礙。由此可見,不同雜種系間雜交親和性程度各不相同,其雜交結實情況受正反交等諸多因素影響,有待進一步研究。

表3 不同品種系間雜交結果

2.4 不同胚挽救方式對幼胚成活的影響

由表4可以看出,不同培養方式對不同雜交組合幼胚的成活率影響較大。子房切片暗培養60 d后,OTOT雜交組合普拉芬多×桌舞與OA雜交組合帕拉左×小月亮的成活率達到50.00%,是羅賓娜×桌舞的4.55倍,之后將成活的幼胚轉接至光下培養60 d左右,僅30 d胚齡的羅賓娜×桌舞、帕拉左×小月亮成活,成活率分別是暗培養的4.55、2.00倍。胚培養60 d左右時,OO雜種系八點后×馬提尼克的萌發率最高,比所羅門之王×索邦高1.40%,比馬提尼克×八點后高16.67%。AA雜種系中僅小珍珠×小月亮萌發,萌發率為65.00%。以東方百合雜種系為母本與亞洲百合、OT百合進行雜交,結果顯示,馬提尼克×閃點的萌發率是馬提尼克×小月亮的2.18倍。

表4 不同培養方式對胚成活率的影響

由圖2可知,馬提尼克×白色海洋、陽光冰島×卡里暗培養60 d左右時,子房經過初期膨大后逐漸褐化死亡;羅賓娜×桌舞和帕拉左×小月亮子房膨大且逐漸生成愈傷組織,之后轉至光下培養,成功獲得了幼苗。所羅門之王×索邦、馬提尼克×八點后、八點后×馬提尼克、小珍珠×小月亮、馬提尼克×小月亮、馬提尼克×閃點、羅賓娜×索邦經胚挽救后均獲得了雜交苗且葉片肥厚、根系粗壯,部分組合胚挽救不成功。綜上可知,不同雜交組合間均存在受精后障礙,胚挽救方式應根據不同雜交組合的胚齡來選擇。

3 討論與結論

在百合的雜交育種中,花粉生活力是評估花粉細胞活性的重要依據之一,其測定結果的準確性決定了雜交育種的成敗[18-19]。本研究結果顯示麝香百合和東方百合花粉生活力較高,在雜交親本的選配中更適合作父本,但本研究表明,麝香百合作父本僅與OT百合激情月球雜交子房膨大率為85.00%,與東方百合馬提尼克、陽光冰島雜交均為0;東方百合作父母本其子房膨大率均等。與花粉生活力測定結果不一致,推測可能是因為授粉受精不僅需要有正常的雌雄配子體親和,還與花粉發芽、花粉管生長等內外因子有關,因此在雜交授粉前,應先采用TTC染色法來快速測定花粉活性,反映花粉的存活狀態,再結合花粉離體萌發法[20],以更準確地選擇授粉親本。

雜交親本的選配是重要的因素之一,本研究對百合系內、系間雜交親和性進行比較,發現無論是系內還是系間品種之間的雜交,雜交組合不同其結果也明顯不同,正反交的子房膨大率和有胚率也存在較大差異。LA雜種系眼線與甜蜜贊比亞系內正反交,其正交親和反交不親和,可能與染色體間的差異[6]或細胞質遺傳基因有關[21],也可能是因為LA遺傳復雜,花粉育性低[17]。東方百合系列與麝香百合系列雜交均不親和,可能是由于花柱長度及系間雜交雙親生理上的不協調造成的[6],也可能是受S基因控制的不親和機制[22]。因此,在今后的雜交育種工作中,為提高育種成功率,應借鑒國內外百合的育種經驗,將親緣關系與同源性差異相結合,以更好地進行雜交親本的選配。

不同的胚挽救方式對不同雜交組合幼胚的成活率影響較大[23]。本研究發現子房切片培養對于 30 d 胚齡的子房最有效,其在暗培養60 d后生成愈傷組織再進行光培養出苗率高達100.00%,與劉曉麗等對新鐵炮百合品種和岷江百合雜交授粉 10～20 d的子房進行切片培養取材時間不同,說明取材時間應根據不同的雜交組合、子房膨大時間來選擇[24]。60～75 d胚齡的幼胚進行適時剝離有利于胚吸收營養,提高萌發率[23],與邵楊等研究結果[25]相一致。本研究發現有部分組合雖獲得有胚種子,但未萌發,與郭朋輝等研究紫斑百合遠緣雜交親和性結果[9]相似,推測其可能是因為胚和胚乳發育不良,胚挽救時間、培養基配方等多種因素造成的,但具體原因還需進一步探究。

本研究以百合不同雜種系的花色、花型、花香、抗性等方面的特點,進行雜交親本的選配,無論是系內正反交還是系間不同品種的雜交,組合不同其雜交結果也明顯不同,不同的胚挽救技術對不同雜交組合幼胚的成活率影響也明顯不同。總體來看,除LA雜種系不親和,其他雜種系系內雜交均不同程度親和;東方雜種系與OT雜種系為母本進行系間雜交親和性更好;不同胚齡的幼胚需要采用不同的胚挽救技術,幼胚培養比子房切片培養更容易獲得雜交后代,成苗率更快。該研究初步探索了不同百合品種雜交親和性規律,為今后百合雜交育種提供了理論參考,同時為創制百合新種質奠定了基礎。