香稻茍當3號香味成分與土壤養分相關性分析

王學良, 王忠妮, 李祖軍, 徐海峰, 龔記熠, 浦選昌, 鄭桂云, 張玉珊, 朱速松

(1.貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550001; 2.貴州省農業科學院水稻研究所,貴州貴陽 550006;3.貴州省黔東南州農業科學院,貴州黔東南 556099; 4.貴州省農業科學院生物技術研究所,貴州貴陽 550006)

我國香稻因具有濃郁的香氣,廣受消費者的喜愛。人們目前普遍認為,香稻中主要香味物質為 2-乙酰-1-吡咯啉2-AP,2-AP的合成主要是因為Badh2基因突變所導致的[1]。Badh2基因會編碼甜菜堿醛脫氫酶,催化4-氨基丁醛轉化為4-氨基丁酸,由此使得2-AP的合成遭到抑制,導致稻米缺乏香氣。當Badh2基因突變后,甜菜堿醛脫氫酶失去活性,抑制了4-氨基丁醛向4-氨基丁酸的轉化,解除了對2-AP合成的抑制,從而使稻米產生了香味[2]。研究發現Badh2的突變類型復雜多樣,在1、2、4、5、7、10、12、13、14外顯子上都有突變位點[3]。最常見的為Badh2.1,即第7外顯子上所發生的8堿基缺失以及3堿基突變,著名香稻Basmati和Jasmine便是這種等位基因型[4]。然而影響稻米香味的物質并不只有2-AP,除2-AP外稻米中100多種物質可產生香味,主要包括醛、酮、醇、烴類等[5]。醛類物質在稻米揮發性物質中占重要地位,其中壬醛、己醛、庚醛、辛醛對稻米香味影響最大[6]。研究發現,香稻的生長條件也會影響自身的香氣濃度,如光照、溫度、水分、肥料、礦質元素、鹽分等因素[7]。徐振江等發現,溫度對稻米香味濃淡有著重要影響,當稻米的生長溫度大于25 ℃時稻米的香味就會有所下降[8]。Bao等的研究表明,利用干濕交替的方式進行灌溉最終會使稻米有更加濃郁的香氣[9]。鐘群等研究發現,氮肥可以增加稻米中游離脯氨酸,并且可以促進2-AP的積累[10]。孫樹俠等研究發現,在氮元素含量較高的種植地稻米中2-AP含量會更高,香味更濃[11]。Mo等研究發現,施硅肥也可以增加稻米中2-AP的含量[12]。Luo等研究發現,硒肥也可以使稻米中2-AP的含量增加[13]。唐湘如等研究發現,在水稻生長期間,噴灑氯化鑭能顯著提高稻米中2-AP的含量,使稻米香味更濃[14]。

茍當3號是貴州省黔東南州精心培育的特有香稻品種,它香氣怡人,品質優良。生產中發現,不同地區種植的茍當3號其稻米香味濃度具有較大差異。為明確茍當3號產生香味以及不同種植點香味濃度差異的原因,本研究分析了茍當3號中Badh2的基因型,并對不同種植點的稻米進行了香味鑒定、揮發性成分分析,以及土壤成分分析,以期揭示不同地區種植的茍當3號香味差異形成的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

茍當3號于2021年種植于貴州省從江縣5個不同地區,種植點從高到低依次為高嶺857 m、機英林637 m、芩木535 m、高大437 m、蝦板242 m。材料進行正常田間管理,抽穗后取葉片置于超低溫冰箱中保存,種子成熟后室溫放置3個月,性狀穩定后稱取飽滿的稻谷20 g,用綠洲鋒速LTJM160型精米機脫殼,用FS-Ⅱ型實驗室旋風式粉碎磨磨成米粉過50目篩,真空包裝,-20 ℃保存。

1.2 香味感官評價試驗

將5 g葉片打碎倒入試管后加1.7%氫氧化鉀溶液,用橡膠塞堵住管口,常溫浸泡10 min后打開試管逐一嗅其氣味,并對香味濃度進行評定。根據Golam等的方法[15]對水稻的香氣進行評分。對樣品按5個標準進行評分,其中1、2、3、4、5分別對應無香氣、輕度香氣、中度香氣、高度香氣、特濃香氣。所有的樣本都由3名經驗豐富的小組成員進行評分。

1.3 茍當3號Badh2基因全長測序

為驗證茍當3號會產生香氣的原因是否為Badh2基因的突變而導致的,對茍當3號的Badh2基因全長進行測序。首先待抽穗后從大田內收取材料的葉片組織采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取材料葉片組織DNA。其次在NCBI網站上搜索Badh2基因的全基因組序列,引物參考Shi等在文獻中設計的10對Badh2基因全長擴增引物[2]。由北京擎科生物科技有限公司合成這10對引物。合成后對茍當3號的DNA進行擴增。其擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電詠檢測合格后送北京擎科生物科技有限公司進行測序,并使用DNAman對測序結果進行對比分析。

1.4 揮發性成分分析

將25 g米粉倒進50 mL頂空進樣瓶中,蓋好瓶口,加入40 mL ddH2O后放置于加熱平臺。于80 ℃進行加熱,一定溫度平衡20 min。平衡后將萃取頭刺穿隔墊,調整高度置于樣品上方5 cm處,萃取吸附40 min后將纖維頭插入氣相色譜-質譜儀進口解吸5 min。進樣口溫度255 ℃,流速1.0 mL/min。起始柱溫為45 ℃,以9 ℃/min的速度升溫,溫度達到255 ℃后保持10 min。電離方式EI,質譜掃描范圍40～500 amu/s,檢索數據庫NIST11。

1.5 土壤檢測方法

pH值采用pH計進行檢測;有機質含量采用重鉻酸鉀滴定比色法測定;全氮含量采用凱氏定氮法測定;全鉀含量采用NaOH熔融火焰光度法測定;堿解氮含量采用堿解擴散法測定;速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定;速效鉀含量采用NH4AC浸提法測定;全磷含量采用堿溶鉬銻抗比色法測定。

1.6 數據分析

使用Thermo TraceFinder 4.1軟件對數據進行處理,未知成分經過檢索后同標準數據庫進行對比。篩選出綜合分大于70同時正反比對分數大于600的物質。將篩選出來的物質的保留指數與NIST library(2017)數據庫進行比對來確定其成分。揮發性物質的相對含量應用面積歸一法計算。數據處理采用Excel 2021。

2 結果與分析

2.1 香味感官評價試驗

本研究在從江縣選取5個地區對茍當3號進行種植。采用KOH浸泡法對5個地區的稻米香味給予評判。由10人組成小組每人2次對材料進行聞香味試驗并對香味濃度進行打分。通過感官試驗,發現不同種植點種植的稻米的香味存在差異(表1)。在高嶺種植點稻米的香味最為濃郁,在蝦板種植點香味得分最低。

表1 稻米香味感官評價排列

2.2 茍當3號Badh2基因全長測序結果

為探究茍當3號產生香味是否為Badh2基因突變所致,對茍當3號中Badh2基因進行測序。序列對比結果顯示,茍當3號的Badh2基因在第7外顯子表現為3 bp突變以及8 bp缺失(圖1),從而斷定茍當3號會產生香氣是由于Badh2基因的突變所致。

2.3 5個不同種植點稻米揮發性成分分析

為了探究茍當3號在不同種植點香味差異的原因是否與2-AP含量有關,本試驗對不同種植點茍當3號中香味揮發物2-AP濃度進行測定。從檢測結果來看不同種植點茍當3號中2-AP的濃度存在差異(表2)。且隨著種植點海拔的升高稻米中2-AP的含量也隨之增加(圖2)。同時為研究其他揮發性物質對茍當3號香味的影響,本研究對5個種植點稻米中的揮發性成分進行分析,檢測出的揮發性成分主要包括醛類(壬醛、己醛、庚醛、辛醛、戊醛、苯甲醛等)、醇類(1-鋅烯醛-3-醇、正己醇等)、酮類(3-己酮、2,3-丁二酮等)(表3)。通過檢測結果發現不同種植點其稻米中的揮發性物質存在較大差異。在高嶺種植點稻米香味最為濃郁,而蝦板種植點香味最低,在高嶺種植點稻米中2-AP與壬醛的含量都高于蝦板種植點,且這2種物質的濃度都隨著種植點的升高而增加。2-AP與揮發性物質相關性分析結果(表4)表明,2-AP與壬醛呈極顯著正相關,與異丁醛則不相關。造成二者間香味濃度差距的主要原因可能是由于稻米中2-AP與壬醛含量的差異。

表2 不同種植點稻米2-AP濃度

表3 茍當3號材料不同海拔高度種植地點各類揮發物質種類及其含量的GC-MS分析結果

表4 2-AP與揮發性物質的相關性分析結果

2.4 不同種植點的土壤特性

為明確茍當3號的香氣濃度與土壤成分的關系,本研究對5個種植點土壤的堿解氮含量、速效鉀含量、有效磷含量、全磷含量、全鉀含量、全氮含量、有機質含量及pH值共8個指標進行測定。檢測結果(表5)顯示以上8個指標在從江縣5個種植點中分布具有較大差異,堿解氮含量在機英林種植點最高,為287.67 mg/kg;有機質含量在高嶺種植點最高,為52.43 g/kg;pH值在高嶺種植點最高,為5.37;全鉀、速效鉀含量在芩木種植點最高,分別為14.36 g/kg、47.06 mg/kg;全磷、有效磷含量在高大種植點最高,分別為1.11 g/kg、30.17 mg/kg;全氮含量最高的種植點為高嶺,為3.02 g/kg。對比5個地區的土壤成分可以發現,堿解氮與有效磷含量的變異系數達到了94.00%,說明這2種成分在不同的土壤中差別較大,變異系數最小的為pH值,說明在不同種植地土壤中變化較小。速效鉀、全磷、全鉀、全氮、有機質含量的變異系數范圍在19%～55%之間,說明這5個指標在不同種植點土壤中具有較大差別。通過對比蝦板與高嶺種植點的土壤成分發現,在高嶺種植點土壤中,除有效磷、全鉀含量外,其他指標均高于蝦板種植點,全氮與有機質的含量更是明顯高于蝦板地區且遠高于5個種植點的平均值。

表5 從江縣不同種植點土壤肥力成分含量

為了研究土壤成分對香味揮發性物質的影響,對土壤成分與香味揮發性物質的相關性進行分析。結果表明,土壤中全氮含量與2-AP、壬醛、庚醛呈顯著正相關,有機質含量與2-AP、壬醛、辛醛呈顯著正相關,pH值與正己醇呈顯著正相關,全鉀含量與己醛、戊醛、異丁醛、2-甲基丁醛呈顯著正相關,全磷含量與糠醛呈顯著正相關,有效磷含量與糠醛呈顯著正相關,全鉀含量與糠醛呈顯著負相關,有效磷含量與異丁醛呈顯著負相關(表6)。

表6 土壤養分與揮發性物質相關性分析結果

3 討論與結論

稻米能否產生香味通常取決于其體內的Badh2基因是否發生突變[16]。Badh2基因的突變類型有很多,現已發現17個突變類型,最常見的為在第7外顯子所發生的8堿基缺失以及3堿基替換,從而造成2-AP的積累[17]。 通過對茍當3號的Badh2基因組進行全長測序基本證實了茍當3號之所以會產生香味是由于其Badh2基因第7外顯子發生突變導致2-AP積累引起的。

除受基因影響外,生長環境也對稻米的香味起重要作用,其中土壤環境最為關鍵,土壤中的全氮、有機質含量在很大程度上影響著稻米的香味[18]。在全氮含量高的地區同一品種的稻米通常會比其他種植點的稻米更具有香氣[19-20]。氮肥能夠提高植株體內的氮含量,利于促進氨基酸的合成,氨基酸是2-AP合成的重要組分,因此增加氮肥有利于提高稻米中2-AP的含量[21-22]。海拔高度會影響環境的溫度、光照等條件從而影響稻米香味的濃度[23]。對不同地區茍當3號2-AP含量進行檢測,發現2-AP濃度會隨著種植點的升高而隨之增高同時稻米的香味也會增加,說明海拔高度對2-AP濃度具有一定的影響。土壤養分與稻米揮發性物質含量相關性分析結果表明,土壤中全氮、有機質含量與2-AP濃度呈顯著正相關,當土壤中全氮、有機質含量升高時2-AP的濃度也會隨之升高,并且稻米的香味也會增加。在高嶺種植點土壤中全氮含量較高,進而促進了2-AP的合成,使該地點的稻米香味更加濃郁,該結果與佟天一等所研究的氮肥對香稻影響的結果[24]基本吻合。同時通過土壤養分與稻米中揮發性物質含量相關性分析發現,全氮含量與4-氨基丁醛呈顯著正相關而與γ-氨丁基酸相關性不顯著。4-氨基丁醛為2-AP合成的前體物質而γ-氨丁基酸是Badh2基因正常無突變的情況下由4-氨基丁醛轉化而來,經檢測發現 4-氨基丁醛含量的上升并未導致γ-氨丁基酸含量的增加,表明茍當3號會產生香味的原因是Badh2基因發生了突變。

香稻中揮發性成分復雜多樣,可達200多種,其中具有香氣的近100種,主要為醛類、醇類、酯類、酮類、烴類以及酚類[25-26]。在茍當3號稻米中所測出的揮發性物質共有16種,其中醛類物質最多,且醛類物質中戊醛、庚醛、己醛、壬醛含量較為突出,這些物質對稻米的香味都具有重要影響。醛類物質閾值很低且對稻米香味有重要影響[27-28]。在檢測到的揮發性成分中我們發現了一個重要的化合物——壬醛。該物質與2-AP具有十分相似的氣味,并且在稻米中的含量也是隨著種植點海拔的升高而逐漸增高。土壤養分與稻米揮發性物質含量相關性分析結果表明,壬醛與全氮、有機質含量呈顯著正相關。2-AP濃度與揮發性物質相關性分析結果表明,2-AP濃度與4-氨基丁醛、壬醛含量呈極顯著正相關。4-氨基丁醛為合成2-AP的前體物質,與2-AP濃度呈正相關,壬醛與2-AP有著相似的氣味并且與全氮、有機質含量呈顯著正相關,因此影響稻米茍當3號香味的另一因素就是稻米中壬醛的含量。

本研究對茍當3號的Badh2基因進行全基因組測序發現在第7外顯子處發生了3 bp突變以及 8 bp 缺失,該突變會造成2-AP的積累。經研究發現,稻米中壬醛的含量也對稻米的香氣有一定的影響,因此造成茍當3號香味差異的主要成分是稻米中2-AP與壬醛的含量。同時結合土壤基本養分與香味揮發性物質含量的分析來看,稻米香味主要受土壤中全氮、有機質含量的影響,因此可以通過改善土壤中有機質、全氮的含量從而進一步提高茍當3號的香味濃度。