黃孢原毛平革菌聯合生物炭對雞糞好氧堆肥木質素降解和腐熟度的影響

翟森茂, 毛欣宇, 陳 星, 匡 偉, 王潤之, 邵孝候

(1.河海大學農業科學與工程學院,江蘇南京 211000; 2.江蘇省科協農村技術服務中心,江蘇南京 210098;3.南京市畜牧家禽科學研究所,江蘇南京 211000)

隨著我國養殖業的規模化發展,每年產生的畜禽廢棄物高達38億t,其中畜禽糞便約為15億t,約占畜禽廢棄物總量的39.5%[1]。其中,雞糞作為一種固體有機廢物,由于富含有機質和氮、磷、鉀等營養物質成為農業有機肥生產的重要原材料[2]。好氧堆肥技術作為固體廢棄物資源化利用的主要方式之一,能將糞便中可降解的生物有機質轉化為穩定、有益、可供植物利用的腐殖質[3]。在堆肥過程中,如何加速堆體腐殖化進程并提高其腐殖質含量是畜禽糞便肥料化處理中的關鍵科學問題,而木質素的高效降解則是解決這一問題的重要研究內容。研究表明,木質素的降解可促使酚類化合物的形成,根據酚-蛋白質理論,酚類化合物被認為是腐殖質形成的重要前體[4],是促進腐殖質形成的關鍵物質。因此,木質素的降解過程也是堆肥腐熟的限速步驟。

木質素由于具有復雜的芳香性結構和高度支化的聚合物網絡,其降解難度大[5]。近年來,關于好氧堆肥過程中真菌對木質素降解的促進作用已有較多研究。降解木質素的真菌主要有黃孢原毛平革菌、褐腐菌和軟腐菌,尤以黃孢原毛平革菌在木質素降解方面的應用最為常見。馬麗婷等研究發現,在堆肥降溫期接種黃孢原毛平革菌可促進雞糞堆肥過程中木質素的深度降解[6];Khatami等研究發現,黃孢原毛平革菌可誘導木質素中的芳香環氧化,加快木質素的降解[7];You等研究發現,褐腐菌可優先降解木質素中的愈創木基,加快木質素的降解[8];Brozonova等研究發現,擔子菌(basidiomycetous)可有效降解木質素[9]。

大量研究發現,添加生物炭可影響堆肥的腐殖化進程,堆肥的腐殖化進程受溫度、pH值、總有機碳(TOC)含量和氨基酸含量等因素的影響。Wang等研究發現,在食物垃圾堆肥中,生物炭可延長堆肥高溫期時間,加快堆肥腐殖化,縮短堆肥時間[10];李安等研究發現,生物炭可提高堆體的pH值,加快堆體的腐殖化[11];Jiang等在城市污泥堆肥中發現,生物炭可有效提高TOC的降解,加快堆體腐殖化[12];Yang等在豬糞與大豆渣的堆肥中發現,生物炭可促進堆體中碳水化合物和氨基酸的降解,提高堆體腐熟度[13]。

目前,以生物炭和真菌作為添加劑,其耦合效應對堆肥木質素降解和腐熟進程的影響還鮮有報道。因此,本試驗以雞糞和稻殼為堆肥原料,分析生物炭聯合黃孢原毛平革菌對堆體基本理化性質、木質素降解和腐熟度的影響,并結合微生物群落結構演替與環境變量的相關性分析,深入解析生物炭聯合黃孢原毛平革菌對木質素降解及腐殖化進程的影響,以期為進一步推動好氧堆肥技術的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

堆肥試驗于2022年5月在南京市畜牧家禽科學研究所進行,堆肥主要原料為新鮮雞糞和稻殼。新鮮雞糞和稻殼取自南京市畜牧家禽科學研究所,稻殼自然風干,粉碎成2～3 cm小段,備用。接種微生物為黃孢原毛平革菌屬(原始編號為NDM3-2,原產地在美國),購自北京保藏生物科技有限公司。生物炭購自平頂山市炭諾環保材料有限公司,由玉米秸稈在600 ℃的缺氧條件(氮氣吹掃)下熱解制得。雞糞、稻殼和生物炭基本理化性質見表1,堆肥試驗在30 cm×20 cm×20 cm的泡沫箱中進行。

表1 堆肥原材料基本理化性質

1.2 試驗方法

試驗設置1個對照和3個處理。空白對照(CK)和各處理中雞糞與稻殼按質量比4 ∶1均勻混合,混合物質量為20 kg。T1處理添加10%(物料干質量)的生物炭,T2處理設置接種0.3%(物料濕質量)的黃孢原毛平革菌,T3處理設置聯合添加10%(物料干質量)的生物炭與0.3%(物料濕重)的黃孢原毛平革菌。采用去離子水調節各處理的初始含水率至65%左右,開展堆肥試驗,采用手動翻堆通風,翻堆頻率為1次/5 d。堆肥周期設置為35 d,每天16:00測量堆體中心溫度,分別在0、1、4、7、14、21、28、35 d取樣。在每個采樣日分別從堆體的上部、中部和下部收集樣品,并混合得到1個組合樣品。樣品一式4份,一份于采樣當天測定含水率;一份于 4 ℃冰箱中冷藏,并在堆肥結束后測定腐熟度指標[腐殖質(HS)、胡敏酸(HA)、富里酸(FA)、pH值、種子發芽指數(GI)];一份自然風干14 d以上,研磨過100目篩后用于測定總碳(TC)、總氮(TN)、TOC以及木質素的含量;另一份真空包裝,在 -80 ℃ 冷凍儲藏,用于ITS1-rRNA測序和后續分析。CK組和處理組各設置3次重復。

1.3 測定項目

溫度由電子溫度計(TP101,創新,深圳)測定。用干質量法測定含水率。取堆肥新鮮樣品與蒸餾水混合(固液比為1 g ∶10 mL)振蕩浸提30 min,靜置 30 min 后過濾,pH值的測量采用多參數分析儀(DZS-706-A,雷磁,上海)對濾液進行測定。GI的測定:取上述水浸提液10 mL放入鋪有濾紙的培養皿中,均勻放入10粒白菜(BrassicacampestrisChinesis)種子,置于25 ℃的培養箱(DHP9040,蘇珀,浙江)中避光培養 72 h,測定種子根長和種子發芽率。TC和TN含量的測定采用元素分析儀(FlashSmart,Sisher)。TOC含量的測定采用Ren等的測定方法[14]。腐殖質組分(HS、HA、FA)的測定參照Zhou等的方法[15]進行,HA與FA之比即為胡富比(H/F)。木質素含量的檢測采用van Soest等的測定方法[16]。真菌群落組成的測定由天根生化科技(北京)有限公司完成。

1.4 數據處理

作圖使用 Origin 2018 完成,顯著性差異分析使用 SPSS 24完成,微生物和環境因子的相關性分析使用R軟件(Version2.15.3)5.0 完成。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程中理化指標及種子發芽指數的變化

由圖1-a可知,各處理的溫度變化均經歷了升溫期、高溫期和腐熟期3個階段,并均在堆肥2 d進入高溫期(>50 ℃)。除CK外,其余處理的堆體溫度均出現≥70 ℃的現象,在5 d進行翻堆之后,各處理堆體均呈現升溫趨勢,其中以T1處理最為明顯,溫度由50 ℃升高至70 ℃,隨后在8～28 d溫度逐漸降低至環境溫度30 ℃左右。堆肥過程中,T1、T2、T3處理的高溫期持續時間為6～8 d,符合《糞便無害化衛生要求》[17]。堆體的含水率變化如圖1-b所示,0～14 d,各處理含水率整體呈明顯下降趨勢,后逐漸趨于平緩,至堆肥結束時,CK、T1、T2和T3處理的含水率分別下降至51.16%、38.70%、43.55%、41.10%。

堆肥過程中pH值的變化如圖1-c所示。CK、T1、T2和T3處理的初始pH值分別為6.04、6.58、6.14和6.41。在堆肥0～7 d各處理的pH值急劇上升,隨后pH值升高速率減緩。堆肥結束時,CK、T1、T2和T3處理的pH值分別上升至8.81、8.93、9.07和9.11,各處理pH值無明顯差異,符合堆肥產品呈弱堿性的要求[17]。

堆肥過程中C/N的變化如圖1-d所示,CK的C/N呈先上升后下降的趨勢,其他處理的C/N呈逐漸下降的趨勢。至堆肥結束時,CK、T1、T2和T3處理的C/N分別由堆肥當天的17.67、23.46、18.67和24.61降至14.62、15.56、10.34和15.85。一般認為,堆肥結束時,堆體C/N低于20可確定堆體腐熟[18]。故CK和各處理均達到了腐熟標準。

總有機碳(TOC)含量的變化如圖1-e所示。可以看出,0～14 d期間,各堆體的TOC含量明顯下降,隨后下降趨勢趨于平緩。至堆肥結束時,CK、T1、T2、T3處理的TOC含量分別由堆肥當天的477.35、504.21、442.41、526.57 mg/kg下降至343.84、345.34、285.71、313.78 mg/kg,TOC降解率分別為27.97%、31.51%、35.42%和40.41%,與前人的研究結果[19-20]一致。結果表明,與其他處理相比,生物炭與黃孢原毛平革菌的聯合添加可有效降解TOC。

堆肥過程中GI的變化如圖1-f所示。可以看出,隨著堆肥的進行,GI值整體呈上升趨勢,堆肥結束時,CK、T1、T2和T3處理的GI分別上升至53.09%、99.32%、65.40%和111.40%。統計分析結果表明,各處理的GI顯著高于與CK(P<0.05),一般認為,70%80%時,堆肥達到完全腐熟[21]。因此,堆肥周期為35 d時,CK、T2處理未達到腐熟,T1、T3處理達到完全腐熟,且T3處理的腐熟度最高。由此可見,生物炭和黃孢原毛平革菌的聯合添加對GI的提升效果最為顯著。

2.2 堆肥過程中木質素與腐殖質的含量變化

圖2為不同處理堆肥過程中木質素的含量變化,整體呈先上升(0～7 d)后下降(7～35 d)的趨勢,這與Wang等在豬糞和鋸末共堆肥中的研究結果[22]一致。這是由于相較于木質素,堆體中糖類、蛋白質、半纖維素、纖維素等有機化合物更易降解,在堆肥前期可被微生物優先利用[23],加之作為木質素降解主體的真菌在前期高溫條件下活性較低[7],進而導致堆肥早期木質素相對富集。木質素下降趨勢在堆肥21～35 d更為明顯,到堆肥結束,CK、T1、T2和T3處理的木質素含量分別由堆肥當天的52.91%、50.27%、51.34%和52.66%分別下降至44.73%、39.16%、43.08%和37.80%,降解率分別為15.46%、 22.10%、16.09%和28.22%。統計分析結果表明,T3處理的木質素降解率顯著高于其他處理,這可能是因為堆肥后期溫度下降,以黃孢原毛平革菌為主體的木質素降解真菌在生物炭的促進作用下,豐度和活性得到大幅提升,優先分解木質素的芳基甘油-β-芳基醚鍵[5],進而加速了木質素的降解進程。

圖3為不同處理堆肥過程中HS含量、HA含量、FA含量和H/F的變化結果, 各組的HS含量在0～7 d迅速增加,隨后呈下降趨勢。堆肥結束時,CK、T1、T2、T3處理的HS含量分別由堆肥當天的30.87、31.05、31.36、31.15 g/kg上升至34.18、36.55、38.22、40.33 g/kg,增幅分別為10.72%、17.71%、21.88%、29.47%。前期HS含量上升是由于堆體中有機質的分解促進了醌類、酚類等HS前體化合物[24-25]的形成,并進一步生成HS,而后期堆體微生物新陳代謝對HS的利用[26]是其含量下降的原因。此外,各組HA含量變化趨勢相似,均呈逐步上升趨勢,堆肥結束時,CK、T1、T2、T3處理的HA含量分別由堆肥當天的7.83、8.01、8.32、8.11 g/kg 增加至10.29、14.60、18.09、20.49 g/kg,增幅分別為31.42%、82.27%、117.43%、152.65%。說明生物炭和黃孢原毛平革菌的聯合添加可以顯著促進HA的合成。

由圖3-c可知,各組FA含量均呈先上升后下降趨勢。0～7 d內,CK、T1、T2、T3處理的FA含量由初始階段的23.04 g/kg分別增加到43.79、40.57、37.07、36.24 g/kg。堆肥結束,CK、T1、T2、T3處理的FA含量分別下降至23.89、21.95、20.13、19.84 g/kg,說明生物炭和黃孢原毛平革菌均可減少堆體中的FA含量。H/F是反映腐殖化產物的聚合度和評價堆肥腐熟度的重要指標[27]。由圖3-d可知,H/F在35 d內總體呈增加趨勢,堆肥結束時,CK、T1、T2、T3處理的H/F分別從堆肥當天的0.35、0.34、0.36、0.35增加到0.43、0.67、0.90、1.03,表明生物炭和黃孢原毛平革菌的聯合添加可有效提高堆肥聚合度。

2.3 微生物與理化因子的相關性分析

由圖4可知,在門水平上,原始物料中的優勢真菌為子囊菌門(Ascomycota)(41.47%),在屬水平上為Kazachstania、Diutina。堆肥1 d,T1和T2處理的優勢真菌在門水平上為子囊菌門(97.52%和84.62%),在屬水平上為莫氏黑粉菌屬(Moesziomyces)、Kazachstania、Diutina,這與大多數研究結果一致。研究發現,子囊菌門在牛糞與玉米秸稈堆肥中的相對豐度超過90%[28],在水稻秸稈堆肥中超過77.58%[29];而T3處理的優勢真菌為子囊菌門(13.22%)和擔子菌門(Basidiomycota)(14.48%),在屬水平上為莫氏黑粉菌屬(Moesziomyces)、Diutina。堆肥結束時,門水平上,堆體的優勢真菌為子囊菌門,在CK、T1、T2和T3處理的占比分別為78.36%、88.09%、46.07%和81.89%;屬水平上,堆體的優勢真菌為曲霉屬(Aspergillus)、微囊菌屬(Microascus)、木霉屬(Trichoderma)、Kazachstania和Diutina。

微生物與理化因子的相關性分析(圖5)表明,含水率與子囊菌門呈負相關性,子囊菌門與木質素含量呈負相關性,Calcarisporiellomycota與HS含量、HA含量、GI具有正相關性,與H/F具有顯著正相關性(P<0.05)。說明含水率的降低可提高子囊菌門的豐度,促進木質素降解;Calcarisporiellomycota豐度的提高可促進HS與HA的形成,提高堆體的H/F和GI。總體而言,微生物因素影響著堆體中的木質素含量,并推動了堆肥的腐殖化進程。

3 討論

本試驗通過設置1個空白對照和3個處理研究發現,生物炭與黃孢原毛平革菌的聯合添加是促進木質素降解的最有效方式。試驗發現,CK和處理的pH值均在0～7 d呈上升趨勢,這主要是因為溫度升高致使堆體中部分氮素以銨態氮的形式揮發[30]。7～35 d,由于NH3和CO2的大量釋放以及有機質的降解,堆體的pH 值逐漸趨于穩定[30],至堆肥結束時,堆體的pH穩定在8.64～8.90。C/N是反映堆肥腐熟程度的重要指標之一。本試驗中,CK的 C/N 呈先上升后下降的趨勢,T1、T2和T3處理的 C/N呈逐漸降低的趨勢。張鶴等在牛糞與玉米秸稈的堆肥中觀察到類似的現象[31],程亞娟等在C/N對雞糞堆肥腐熟指標的影響研究[32]中也得出相似的結論。至堆肥結束時,CK和處理的C/N降至10.34～15.85,均達到了腐熟標準。TOC含量的變化反映了堆肥中礦化和腐殖化的程度,并顯著影響堆肥質量[33]。本試驗中所有處理的TOC含量均呈明顯下降趨勢,這與Ye等在雞糞堆肥過程中的研究結果[34]一致,Zhang等在雞糞與玉米秸稈的堆肥試驗[35]中也發現類似的結果。 而TOC的降解為HA前體的形成提供了碳源,促進了HA的形成。GI則呈明顯上升趨勢,且T3處理的GI達到111.40%,顯著高于CK。

木質素是一種大量存在于植物維管組織中的芳香族聚合物,由葡萄醇、針葉鐵醇和對香豆醇構成。這些單烯醇分別被稱為S、G和H單位,通過C—O—C和C—C相互連接[36],是堆肥過程中最難以降解的芳香族化合物之一,故0～21 d堆體的木質素含量下降緩慢,隨著堆肥的進行,堆體溫度逐漸降低,以子囊菌門為主的真菌代謝逐漸增強,致使木質素的降解速率加快[37],堆肥結束時,T3處理的木質素降解率達到28.20%,顯著高于其他處理,說明生物炭和黃孢原毛平革菌的聯合添加可有效加快木質素降解。木質素的氧化物通常組成了HS的“核”,是形成HA的重要前體物質[38]。本試驗中堆體的HS含量均呈先增加后降低,最后趨于平緩的趨勢。早期階段,HS的增加是由于堆體中有機質組分的降解和腐殖質類物質如醌類和酚類物質的聚集導致的[24],而HS含量在7～14 d內下降的原因是微生物對HS中部分化合物的降解。同時發現,HA含量在0～7 d整體呈逐漸上升趨勢,這與Bai等的研究結果[24]一致,其中T2處理的HA含量顯著高于其他處理,這可能是因為堆體中被孢霉門(Mortierellomycota)對有機碳的固定作用, 為HA前體的形成提供了碳源,說明堆肥前期單獨施用黃孢原毛平革菌對促進HA的形成具有顯著作用。14～35 d,所有處理的HA含量逐漸上升,這可能是因為堆肥后期溫度降低,微生物的活性增強,提高了堆體中有機質的降解[39]。至堆肥結束時,T3處理的HA含量較堆肥當天提高了152.56%,并高于其他3個處理。FA含量在0～7 d呈上升趨勢,后期呈下降趨勢,這與Li等在豬糞堆肥過程中的結果[40]一致。前期FA含量的增加是因為毛霉門(Mucoromycota)胞外酶的分泌加快了纖維素與半纖維素的降解[41],進而促進FA的合成[27]。 而后期下降是因為堆體溫度降低導致微生物的代謝增強,加快了FA 的降解[42]。

本試驗發現,堆肥1 d,門水平上,T1、T2處理的優勢真菌為子囊菌門,T3處理的優勢真菌為子囊菌門(13.22%)和擔子菌門(14.48%),這與Huang等在污泥堆肥中的研究結果[43]一致,Duan等在豬糞堆肥過程中也發現類似的結果[44],子囊菌門和擔子菌門產生的孢子具有耐高溫的特性,是礦化和降解木質素的關鍵微生物[45-46],這可能是T3處理的木質素降解率高于CK和其他處理的原因之一。但Wang等研究發現,在牛糞堆肥過程中的優勢真菌門為Mycothermus,這可能是肉牛特殊的消化系統導致的[45]。堆肥后期,由于曲霉屬分泌具有木質素降解功能的過氧化酶[46],致使木質素降解率提高。值得注意的是,沒有分科名稱或明確分類信息的真菌在各個時期的真菌群落均占有較大的比例,這與Wang等的研究結果[47]一致,而這些真菌可能與高溫期木質素的降解和HA的形成有關[47]。相關性分析表明,含水率的降低可提高子囊菌門的豐度,促進木質素降解;Calcarisporiellomycota豐度的提高可促進HS與HA的形成,提高堆體的H/F和GI。故今后可關于子囊菌門與Calcarisporiellomycota的耦合對堆肥過程中木質素降解、堆肥腐熟度的影響作進一步研究,以期對微生物降解木質素的機制作進一步闡釋,提高木質素降解與有機肥的品質。

4 結論

生物炭與黃孢原毛平革菌的聯合添加可有效提高TOC的降解率和GI。堆肥結束時,T3處理的TOC降解率(40.41%)和GI(111.40%)最高。

生物炭與黃孢原毛平革菌的聯合添加可有效提高木質素的降解率和堆體的腐熟度。堆肥結束時,T3處理的木質素降解率達到28.20%,HS含量提高29.47%,HA含量提高152.65%,均高于其他處理;FA含量降低45.25%;H/F由堆肥當天的0.35上升至1.03。

微生物群落多樣性分析表明,子囊菌門是堆肥過程中的優勢真菌,含水率的降低可提高子囊菌門的相對豐度,促進木質素的降解;Calcarisporiellomycota豐度的提高可促進HS與HA的形成,提高堆體的H/F和GI。

綜合考慮,在雞糞堆肥中,生物炭和黃孢原毛平革菌聯合添加是提高木質素降解率和堆體腐殖質化的合理方法。