腎炎1號方治療慢性腎炎大鼠的血清代謝組學研究

陳 偉,梁國強,蔣春波

南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院,蘇州 215009

慢性腎炎是以慢性腎小球病變為主的腎小球疾病,發病因素比較復雜。目前學者普遍認為慢性腎小球腎炎與急性腎炎之間并無直接的關聯,據統計,從急性腎小球腎炎轉變至慢性腎小球腎炎的病例約占15%～20%[1],絕大多數病例可能是細菌、病毒或原蟲等感染并通過免疫機制或非免疫機制等導致的[2-4]。

腎炎1號方是蘇州市中醫醫院的院內制劑,由腎內科金偉民教授針對“氣虛濕阻”病機特點的慢性腎臟疾病所創制[5],經過多年的臨床使用表明,腎炎1號方能改善阿霉素造模的慢性腎病大鼠模型的蛋白尿,減輕大鼠腎臟足細胞損傷[6-8]。腎炎1號方聯合西藥治療腎病綜合征時,可顯著改善機體免疫及凝血功能的相關指標[9-11]。

本課題組用基于液質聯用技術的代謝組學方法[12-15],研究模型組及給藥組大鼠血漿中代謝物水平的變化,獲得差異代謝物,從代謝通路異常變化的角度探討腎炎1號方對阿霉素導致的腎炎治療機制并尋找其潛在藥理效應標志物,為該復方的臨床深入研究奠定相應的實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters e2695,美國Waters 公司);蒸發光散射檢測器(ELSD 6000,美國奧泰公司); 高分辨質譜儀(AB SCIEX Triple TOFTM 5600,美國AB公司);十萬分之一分析天平(MS105)、萬分之一電子分析天平(AL210),均購自梅特勒-托勒多儀器有限公司。

1.2 試藥

腎炎1號口服液(批號20200813,蘇州市中醫醫院自制院內制劑);鹽酸阿霉素(德國Ruibio公司);色譜純乙腈、色譜純甲酸均購自德國默克公司;水為超純水(Millpore Q3超純水儀制備)。

1.3 動物

SD雄性大鼠,80只(180～220 g),購自昭衍新藥研究中心有限公司,許可證號為SCXK(蘇) 2013-0003。

2 方法

2.1 動物造模及分組

取60只SD大鼠,累計劑量為 5 mg·kg-1,分別于實驗第1天(4 mg·kg-1)和第8天(1 mg·kg-1)對造模大鼠尾靜脈注射阿霉素,第14天后 24 h測定造模大鼠的尿蛋白,排泄定量≥50 mg·kg-1即為造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、腎炎1號方低劑量組、腎炎1號方高劑量組,每組20只,另外取20只大鼠設為空白組,空白組注射等體積生理鹽水。

2.2 動物給藥

治療組以10 g生藥·kg-1的劑量灌胃給予腎炎1號方;模型組和空白組每日灌胃給予等體積生理鹽水,連續給藥4周。

2.3 血樣采集及處理

末次給藥2 h后于大鼠股動脈取血,血漿靜置20 min后離心分離血清,取50 μL血清置于EP管中,加入乙腈200 μL,渦旋混勻,離心2次,上清液用氮氣吹干,加入乙腈100 μL復溶,離心,吸取上清液至進樣瓶中待測。

2.4 血樣分析

將處理好的樣本注入液質聯用色譜儀進行色譜分析。

2.4.1色譜條件 色譜柱 ACCUCORE 150-AMIDE-HILIC色譜柱(100 mm ×3.0 mm,2.6 μm);流動相為A相(乙腈),B相(1 mL·L-1甲酸),梯度洗脫,見表1,流速為1 mL·min-1;分流比為3∶1;柱溫為30 ℃;進樣量為4 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.4.2質譜條件 ESI離子源,用正離子模式檢測;干燥氣溫度為350 ℃,流速為9 L·min-1,毛細管電壓為4 500 V,霧化器壓力為45 psi,Skimmer為65 V。碎裂電壓為125 V,OCTLRFVPP為250 V。用質心模式采集,速率為1.5 Spectras,離子碎片掃描范圍50～1 500。用Aglient混合校正溶液(m/z=112.985 578,1 033.988 109)作為鎖定質量。二級質譜用Q-TOF(XevoG2)鑒定,正負離子模式檢測,碰撞能量為20 eV。

2.5 統計學方法

首先用主成分分析(PCA)對數據進行總覽,對樣本分布及異常值進行分析,然后用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS- DA)對數據模型進行分析,篩選出VIP值大于1 的代謝物。此外,數據之間用SPSS 20.0進行t檢驗,結合VIP值與P值篩選出差異代謝物。

3 結果

3.1 各組的液質分析圖譜

見圖1。由圖1可知,各組色譜峰之間分離度較好,在此基礎上,本研究用多種分析方法對各組別之間的差異代謝物進行分析。

注:A.空白組;B.模型組;C.腎炎1號方低劑量組;D.腎炎1號方高劑量組。

3.2 模式識別分析

3.2.1PCA分析 對樣本總體數據進行PCA分析,模型參數R2X[1]值為0.282,R2X[2]值為0.127,表明模型可信度較高,見圖2,證明正常組、模型組、腎炎1號方低劑量組與腎炎1號方高劑量組之間存在顯著的代謝差異[16],由圖可以看出慢性腎炎經低劑量與高劑量腎炎1號方治療之后代謝物接近于空白組,且高劑量組更明顯。

3.2.2正交偏最小二乘方法判別分析 對正常組、模型組、腎炎1號方低劑量組與腎炎1號方高劑量組OPLS-DA進一步分析,見圖3、圖4 。OPLS-DA 置換圖中,腎炎1號方高劑量組與模型組對比R2X[1]=0.241、R2X[2]=0.053 2,表明此模型穩定性和預測性較好,說明該模型擬合效果良好[16],血清中顯著存在差異代謝物。腎炎1號方高劑量組與模型組比較,Q2在y軸上的截距為-0.229,表明分析模型穩定可靠。

3.3 特征性化合物分析

將腎炎1號方高劑量組與模型組質譜數據進行相關數據庫檢索分析,經過分析篩選后得到18個差異代謝物,在這些差異代謝物中有 13個發生上調(羥脯氨酸、纈氨酸、琥珀酸、植物鞘氨醇2等)、5個發生下調(對甲酚、肌醇半乳糖苷、聯苯、2羥基異丙醇胺等)[17],結果見表2。

表2 模型組與腎炎1號方高劑量組差異代謝物結果

3.4 主要代謝通路分析

對18個差異代謝物以KEGG數據庫進行代謝途徑富集分析,見圖2至圖5。結果表明腎炎1號方發揮藥效主要通過乙醛酸、二羧酸、泛酸鹽、輔酶A、檸檬酸、丁酸甲酯及半乳糖代謝途徑等實現。

注:K.空白組;M.模型組;L.低劑量組;H.高劑量組。

注:K.空白組;M.模型組;L.低劑量組;H.高劑量組。

圖4 腎炎1號方高劑量組與模型組的OPLS-DA置換檢驗圖

圖5 代謝通路分析圖

4 討論

代謝組學是對生物體被干擾或刺激后,機體內代謝物隨時間變化的研究。本研究用液質聯用技術與多元變量統計學對正常SD大鼠、模型SD大鼠以及中高劑量給藥的慢性腎炎SD大鼠血清進行代謝組學分析,篩選出阿霉素慢性腎炎SD大鼠血清中差異代謝物(羥脯氨酸、環亮氨酸和天冬氨酸),表明氨基酸代謝在慢性腎炎臨床發病以及治療過程中扮演著重要的角色[18-19],研究表明,慢性腎炎患者的蛋白質攝入被抑制,而通過調節氨基酸代謝[20]可用于防治慢性腎炎。

本研究由于樣本造模較困難以及樣本間存在一定的差異性,研究初期用小樣本量進行探索實驗,結果必然存在著局限性,后期還需要進一步擴大實驗樣本量進行數據可靠性的驗證。未來我們將進行在體動物實驗以及離體分子生物學實驗,同時還將進行相關酶機制的研究,多手段結合以深入探究慢性腎炎與氨基酸代謝之間的關聯,探尋通過氨基酸代謝相關酶的過表達對慢性腎炎的治療促進效用。后期還可以考慮將對應的氨基酸代謝物設為靶標[21],對其進行相關的臨床檢測可以提示慢性腎炎的發生,以便及時對風險人群的用藥加以干預治療,造福社會。